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孤雌激活人体外成熟卵母细胞和人孤雌胚胎干细胞建系的初步探讨

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人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是指从人囊胚期分离内细胞团(inner cell mass，ICM)能在体内长期增殖并保持未分化，同时具有多向分化潜能的一类细胞。近年来，关于hESCs诱导分化为表皮样干细胞、神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等方面的研究取得一定的进展。成功建立的hESCs系已被广泛应用于生命科学的许多领域，它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。目前，人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stemcells，hPESCs)系的成功建立为hESCs建系提供崭新的来源，是预防移植细胞免疫排斥的潜在方法。但是人成熟卵母细胞来源十分有限，我们试图采用新的卵母细胞资源获得孤雌发育的胚胎，初步探讨hPESCs建系和鉴定的相关内容。本研究在人卵母细胞来源、孤雌激活条件、hPESCs的培养体系的建立等方面为应用孤雌生殖技术建立hPESCs系提供了新的思路。
　　 目的：了解电脉冲联合6-甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)孤雌激活人体外成熟卵母细胞后，获得的孤雌胚胎的发育潜能；初步探讨hPESCs的建系与鉴定工作。
　　 方法：未见第1极体排出的不成熟人卵母细胞，经过在体外受精(in vitrofertilization，IVF)培养液中体外培养，共获得减数分裂Ⅱ期(MⅡ)成熟卵母细胞117个，随机分两组。处理组成熟卵母细胞予以电脉冲联合6-DMAP孤雌激活，共59个；对照组不予人工孤雌激活，共58个；对比观察两组活化效率和胚胎早期的体外发育效率；继续观察并筛选发育至囊胚阶段的孤雌胚胎，机械法分离ICM，原代克隆培养。建立hPESCs的培养方法：将hPESCs接种在经过丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)处理的人包皮成纤维细胞(human foreskinfibroblasts，HFF)上，培养基含80％KnockOut-DMEM、20％Knock-Out血清替代物(Knockout serum replacement，KSR)及8ng/mL碱性成纤维生长因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)等，用0.05％胰酶(0.05％trypsin-EDTA)消化细胞进行连续传代，经特异性标记物染色与核型检测达到鉴定hPESCs的目的。
　　 结果：
　　 1、电脉冲联合6-DMAP孤雌激活人体外成熟卵母细胞，处理组活化率为32.20％，对照组活化率为12.07％，处理组活化率明显高于对照组，组间差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 2、处理组卵裂率为21.10％，囊胚形成率为25.00％；对照组卵裂率为57.10％，囊胚形成率为0.00％。经过统计学分析，对于处理组和对照组的卵裂率、囊胚形成率来说，组间差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 3、处理组中的1个电脉冲联合6-DMAP孤雌激活的孤雌胚胎发育至囊胚阶段，分离ICM、原代培养并接种于HFF饲养层上，可以使hPESCs呈克隆样生长，命名为hPESCs-081012，利用本研究建立的hPESCs培养体系，体外长期扩增超过20代，生物学鉴定符合hESCs标准。
　　 4、hPESCs特异性标记物免疫组化染色
　　 在HFF饲养层上生长的hPESCs克隆，抗Oct-4抗体免疫组化染色呈绿色荧光，抗SSEA-3抗体和抗SSEA-4抗体染色呈红色荧光，抗SSEA-1抗体染色未见明显荧光显色。
　　 5、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)染色
　　 AP染色可见hPESCs克隆呈蓝紫色着色，而HFF饲养层细胞未见着色
　　 6、核型检测
　　 hPESCs-081012细胞系体外培养20余代，核型保持正常：46，XX。
　　 结论：电脉冲联合6-DMAP能够有效孤雌激活人体外成熟卵母细胞。本研究成功建立适合的HFF饲养层与HPESCs培养体系，维持HPESCs-081012保持高度增殖及不发生自发分化的特性。

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