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骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石修复兔颅骨缺损的研究

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前言

第一部分 兔骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化能力的研究

第二部分 兔骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石修复颅骨缺损的研究

参考文献

致谢

附录综述 骨组织工程材料的研究进展

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摘要

目的 大面积颅骨缺损的修复一直是神经外科临床工作的一个重点，其关键问题是修复材料的来源，而传统的修复材料存在各种各异的缺点。随着组织工程的飞速发展，体外预构的组织工程骨有可能为颅骨缺损提供较理想的修复方式。本试验探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学特性和成骨分化能力，研究以BMSCs为种子细胞、10％珊瑚羟基磷灰石(CHA)为细胞外基质材料构建的组织工程骨的成骨能力。 一、兔BMSCs的生物学特性和向成骨细胞诱导分化的能力 方法 以密度梯度离心法(1.073g/ml的淋巴细胞分离液)和贴壁筛选法获得兔BMSCs，原代培养后1∶3传代，分别接种于普通DMEM培养基(A组)和添加成骨诱导剂(含10-9mol/L地塞米松(DEX)、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/LL-抗坏血酸(L-ASC))的DMEM培养基(B组)。定期更换培养基，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。用MTT法分析BMSCs在两种培养条件下的生长活力。检测两种培养条件下BMSCs向成骨细胞分化的指标，包括定量法检测第1、2、3、4周时碱性磷酸酶(ALP)的表达，免疫组化法检测第4周时BMSCs分泌Ⅰ型胶原和四环素荧光法检测第5周时矿化结节的形成。 结果 密度梯度离心法和贴壁筛选法从骨髓中获得可贴壁增值、呈纺锤形的BMSCs。在普通培养(A组)和成骨诱导培养(B组)条件下BMSCs从第3天开始快速增值，第8天达到最高峰；在3-8天细胞数两组间有显著差异性。ALP定量检测示A、B两组BMSCs在4周时表达量明显升高，有显著差异性。4周时Ⅰ型胶原免疫组化B组阳性率90％，A组无阳性细胞。5周时矿化结节四环素染色于荧光显微镜下可见B组矿化结节呈黄绿色，A组无矿化结节。 结论 骨髓是良好的间充质干细胞来源，通过密度梯度离心法结合贴壁法能从兔骨髓中提取到BMSCs，经过培养传代后可获得足量的细胞。10-9mol/LDEX、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/LL-ASC联合诱导下，能够明显促进BMSCs向成骨方向的分化，表现为ALP的表达、Ⅰ型胶原的分泌和矿化结节形成，是促使BMSCs向成骨方向分化的良好的诱导剂。通过诱导BMSCs成骨分化并结合细胞形态学观察，可以初步鉴定所获得的成纤维样细胞符合BMSCs的特点。 二、兔BMSCs复合10％珊瑚羟基磷灰石修复颅骨缺损 方法 原代培养的兔BMSCs以1∶3传代，接种于添加成骨诱导剂(10-9mol/LDEX、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/LL-ASC)的DMEM培养基。定期更换培养基，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。收集第4代经成骨诱导的细胞，以5×10-7/ml的密度接种于10％CHA，培养1，3和7天后作扫描电镜检查。以培养7天的10％CHA+BMSCs复合物植入兔颅骨直径1.5cm缺损处为试验组(A组，n=8)；单纯植入CHA(B组，n=4)和无任何植入物(C组，n=4)为对照组。A组于6和12周、B和C组于12周时行X线检查；行X线后分别处死动物，观察修复后颅骨表面的完整性、硬度、与周围自体骨质的结合情况等；然后取材固定、脱钙、包埋、切片，行HE染色。 结果 BMSCs向成骨诱导分化后，与10％CHA复合培养3-7天，扫描电镜显示细胞能在10％CHA很好地黏附生长。大体观察可见A组6、12周时组新生骨质地硬，与周围自体骨结合紧密；B组12周时表面粗糙，呈颗粒状，质地软，周围包绕组织囊；C组仅有软组织填充。X线检查可见A组植入物与自体骨密度基本一致，两者结合紧密；B组密度明显降低，呈颗粒状密度影，和自体骨结合不紧密；C组仅可见软组织密度影。HE染色示A组有大量新骨形成，新生骨之间相互结合，有血管长入，未见炎细胞和淋巴细胞浸润。B组可见材料明显降解，无新生骨。C组仅可见结缔组织。 结论 10％CHA有良好的生物相容性、良好的细胞材料表面、适当的生物降解性和三维立体结构，是骨组织工程良好的细胞外基质材料。BMSCs是骨组织工程理想的种子细胞，可在10％CHA表面紧密黏附生长。以BMSCs为种子细胞，10％CHA为支架材料构建的组织工程骨，在兔颅骨缺损处有明显的成骨，无明显的免疫排斥反应，可能成为临床颅骨缺损修复的自体骨来源之一。

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