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EgM9、EgM123蛋白免疫犬持续期抗体检测与免疫组织化学研究

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第1章 绪论

1．1 包虫病的流行现状

1．2 细粒棘球绦虫的生活史及结构

1．3 细粒棘球绦虫的基因型

1．4 EgM家族蛋白

1．5 棘球蚴病的综合防治

1．6 免疫组织化学的发展

1．7 疫组织化学常用方法

1．8 免疫组织化学方面的进展

1．9 免疫组织化学的应用

1．10 研究的目的和意义

第2章 EgM123重组蛋白的诱导表达、纯化及其抗体制备

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第3章 重组蛋白(EgM9、EgM123)免疫犬持续期的抗体变化检测

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

第4章 对EgM9、EgM123蛋白免疫犬的肠系膜淋巴结及小肠组织的免疫组织化学研究

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

第5章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

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摘要

细粒棘球蚴病是细粒棘球属的细粒棘球绦虫幼虫所引起的人畜共患寄生虫病，俗称包虫病（Hydatid disease）。据统计，由于动物感染包虫病，每年使我国畜产品经济损失达5亿元以上，给当地居民的身体健康和畜牧业的生产与发展带来巨大的危害。研究显示，用EgM家族(EgM9、EgM123)蛋白免疫过的犬可获得80％以上的免疫保护效果。但是有关EgM家族(EgM9、EgM123)蛋白免疫效果的持续期研究尚且不全。因此，本研究对EgM9、EgM123两种蛋白免疫犬后0～27周相关血清抗体效价、淋巴因子、小肠组织及肠系膜淋巴结抗体靶位点分布情况进行了检测，旨在了解免疫后两种抗体的持续变化情况，为终末宿主免疫预防研究提供试验依据。
　　1.采用SDS碱裂解法提取pET41b-EgM123质粒，酶切获得EgM123基因，对EgM123基因进行亚克隆并测序，克隆后基因与原核表达载体pET28a连接、转入大肠杆菌BL21。测序分析和SDS-PAGE分析表明，获得的EgM123基因片段大小为657 bp，与GenBank中登录号为AF482718的基因序列同源性为100％，诱导表达的pET28a-EgM123分子量30 kD。Western blott检测显示，阳性血清与pET28a-EgM123重组蛋白在30 kD处有清晰的特异性结合条带，显示出良好的反应活性。
　　2.将纯化的pET28a-EgM123重组蛋白免疫健康新西兰大白兔，并通过ELISA检测免疫过的新西兰大白兔的血清中特异性抗体水平。结果显示，获得了高效价的特异性抗血清，其效价达1∶320000以上。
　　3.实验犬分为三组，分别用EgM9蛋白、EgM123蛋白及PBS进行免疫，免疫三次，每次免疫间隔2周，第5周经口服感染源头蚴，0～27周之间定期采血，用ELISA检测法检测血清抗体效价及血清中（IFN-γ、IL10）和第27周血浆中（IFN-γ、IL4）两种淋巴因子含量。结果显示，三免后一周抗体水平达到最高，攻击原头蚴后，抗体水平随之下降，免疫时间达到16周，免疫组抗体与对照组的差异不显著（P＞0.05）。第5周时各组血清中IFN-γ的含量均达到最高，之后呈现下降趋势;第5周后PBS组血清中IL10含量显著高于EgM9蛋白免疫组及EgM123蛋白免疫组(P＜0.05)。第27周PBS组血浆中IFN-γ含量低于EgM9蛋白免疫组及EgM123蛋白免疫组(P＜0.05);各组血浆中IL4含量差异不显著(P＞0.05)。
　　4.采用免疫组织化学技术分别对三组犬肠系膜淋巴结及小肠组织进行IgG抗体靶位点检测，EgM9蛋白免疫犬7周的肠系膜淋巴结及小肠组织作为标准阳性Ⅰ组。结果显示四个实验组都存在IgG抗体靶位点，进一步进行三步法，Ⅰ组（标准阳性样）呈现棕色，反应强阳性，27周的肠系膜淋巴结及小肠组织样品Ⅱ组(EgM9)和Ⅲ组(EgM123)弱阳性，PBS组免疫组化反应阴性;三步法可以定位检测免疫犬肠系膜淋巴结和小肠上的IgG靶位点抗体富集程度。
　　免疫组织化学及抗体检测结果显示随着免疫持续期延长，EgM家族蛋白免疫犬血清抗体水平呈现下降趋势，肠系膜淋巴结和小肠组织特异性抗体也随之减少。

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