NLRP3炎症小体信号在高糖和脂多糖诱导的肾系膜细胞中的表达及作用机制研究

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目的:糖尿病肾病是糖尿病特异性微血管并发症之一，是西方终末期肾病的主要原因。糖尿病肾病起病隐匿，发病机制不清。目前认为炎症反应是糖尿病肾病发病机制的中心环节。固有免疫是机体组织的第一道防线，它通过模式识别受体识别和结合病原体上的病原相关分子模式（如病毒、细菌）和自身损伤相关分子模式（如高血糖、高血脂），启动机体炎性反应，应答环境中的微生物及理化损伤，以维持机体内环境稳态。NLRP3炎症小体是固有免疫家族的重要成员，它不仅是炎性免疫反应的“感受器”，亦是炎性免疫反应的“调节器”。NLRP3炎症小体能够识别外源性和内源性危险信号，激活Caspase-1，活化IL-1β、IL-18、IL-33等炎性因子，触发炎症瀑布效应。NLRP3炎症小体在代谢性疾病炎症中扮演着重要角色，然后其在糖尿病肾病中的作用及机制尚不明确。本研究通过观察NLRP3炎症小体信号通路在高糖、脂多糖(LPS)以及活性氧(ROS)抑制剂NAC作用下肾系膜细胞的表达，旨在探讨NLRP3炎症小体信号在糖尿病肾病炎症激活过程中的调控作用及相关机制，找到以NLRP3炎症小体信号通路为靶点防治糖尿病肾病的理论依据和新思路。
　　方法:1、体外实验:(1)细胞培养及分组:体外培养大鼠肾小球系膜细胞，以高糖和脂多糖作为刺激因子，活性氧抑制剂NAC作为阻断剂，分别设以下六组:①正常对照组(NC组):5.6mmol/L葡萄糖;②不同浓度高糖组（HG组）:HG1:10mmol/L葡萄糖，HG2:20mmol/L葡萄糖，HG3:30mmol/L葡萄糖;③甘露醇对照组（OP组）:5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇;④高糖+NAC组（HG+NAC组）:表达较强浓度的高糖+10μmol/L NAC;⑤不同浓度脂多糖组（LPS组）:LPS1:1ug/L LPS，LPS2:5ug/L LPS，LPS3:10ug/L LPS;⑥脂多糖+NAC组（LPS+NAC组）:表达较强浓度的脂多糖+10μmol/L NAC。(2)各组细胞分别培养6、12、24h后，用蛋白免疫印迹法、RT-PCR检测各组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、硫氧还结合蛋白(TXNIP)蛋白及mRNA表达。2、体内实验:(1)糖尿病模型建立及分组:雄性Wistar大鼠20只，随机分为糖尿病模型组（10只）和正常对照组（10只），糖尿病模型组一次性腹腔注射链脲佐菌素（60mg/kg），正常对照组给予等体积的枸橼酸缓冲液腹腔注射。(2)分别饲养6周和8周，收集各组大鼠尿液检测24h尿蛋白定量;心脏采血检测空腹血糖;取肾脏组织行免疫组化检测各组TXNIP、IL-1β的表达。3、统计学分析:应用SPSS11.5统计软件分析数据。数据以均数±标准差（(x)±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验，组内比较采用独立样本均数t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05有统计学意义。
　　结果:1、体外实验:(1)高糖刺激肾系膜细胞NLRP3炎症小体信号分子的表达变化:与正常组相比，不同作用浓度和时间的高糖均可上调TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表达(P＜0.05)，且呈浓度/时间依赖性，以30mmol/L葡萄糖作用24h表达最强。(2)脂多糖刺激肾系膜细胞NLRP3炎症小体信号分子的表达变化:与正常组相比，不同作用浓度和时间的脂多糖均可上调TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表达(P＜0.05)，也呈一定浓度/时间依赖性，以10ug/L脂多糖作用12h达峰值。(3)予NAC干预高糖及脂多糖后，肾系膜细胞NLRP3炎症小体信号分子的表达变化:与高糖组相比，预先加入NAC阻断氧化应激可阻止高糖诱导的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TXNIP蛋白及mRNA表达增强(P＜0.05);与脂多糖组相比，预先加入NAC可阻止脂多糖诱导的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TXNIP蛋白及mRNA高表达(P＜0.05)。2、体内实验:(1)大鼠一般情况指标:与正常组相比，糖尿病组体重增加明显延缓(P＜0.05)，而空腹血糖及24h尿蛋白定量则显著升高(P＜0.05)。各组大鼠的体重、血糖、24h尿蛋白定量饲养8周较6周无明显差异(P＞0.05)。(2)肾脏免疫组化结果:正常组肾小球内几乎没有TXNIP和IL-1β的表达，而糖尿病组TXNIP和IL-1β蛋白的表达显著增加，且8周较6周TXNIP和IL-1β的表达增加更明显。
　　结论:高糖及脂多糖可通过ROS-TXNIP-NLRP3-IL-1β炎症小体信号通路介导糖尿病肾病炎症反应的发生。

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作者
冯红;
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作者单位

西南医科大学;

泸州医学院;

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授予单位西南医科大学;泸州医学院;
学科内科学
授予学位硕士
导师姓名徐勇;
年度 2014
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R587.202;
关键词
糖尿病肾病; 病理机制; NLRP3炎症小体; 高糖; 脂多糖; 炎症反应;

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