首页> 中文学位 >小肽转运载体2在奶牛乳腺上皮细胞Met-Met摄取中的作用及其调控机制研究
【6h】

小肽转运载体2在奶牛乳腺上皮细胞Met-Met摄取中的作用及其调控机制研究

代理获取

目录

声明

图表一览表

缩略词表

摘要

第一章 文献综述

第一节 乳蛋白合成与调控

1 乳蛋白合成

2 乳蛋白合成调控

第二节 小肽在动物生产中的应用

1 小肽营养概述

2 小肽对乳蛋白合成的调控

第三节 乳腺内介导氨基酸和小肽调控乳蛋白合成的信号通路

1 mToR信号通路及其对乳蛋白合成的调控

2 JAk2-STAT5信号通路及其对乳蛋白合成的调控

第四节 小肽转运载体的功能及其调控

1 小肽转运载体的种类

2 小肽转运载体的结构

3 小肽转运载体的功能

4 小肽转运载体的底物

5 小肽转运载体的表达及功能调控

第五节 翻译后修饰对蛋白功能的调控

1 糖基化及其对蛋白功能的调控

2 泛素化及其对蛋白功能的调控

第六节 本研究的目的与内容

2 本研究的主要内容

第二章 Met-Met对BMECs乳蛋白合成的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三章 小肽转运载体在奶牛乳腺中的表达及其在小肽摄取中的作用

第一节 奶牛乳腺上皮细胞对模拟肽胞内摄取机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二节 奶牛乳腺上皮细胞对蛋氨酸二肽胞内摄取机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四章 N-糖基化对PepT2功能的影响及其调控机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第五章 mTOR信号因子对PepT2功能的影响及其调控机制

第一节 mToR对奶牛PepT2的调控作用

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二节 Nedd4-2介导mTORC1对bPepT2功能的调控

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第六章 综合讨论

提示、创新点与研究展望

1 提示

2 创新点

3 研究展望

参考文献

致谢

个人简历

展开▼

摘要

本研究利用原代奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)体外培养模型,系统研究了小肽转运载体2在奶牛乳腺上皮细胞小肽摄取中的作用及其调控机制。首先,研究蛋氨酸二肽(Met-Met)对BMECs乳蛋白合成的影响及其机制。其次,探讨了小肽转运载体2(PepT2)在小肽(Met-Met和模拟肽β-Ala-Lys-AMCA)摄取中的作用,并研究了N-糖基化和雷帕霉素蛋白(mTOR)对小肽摄取的调控作用及其机制。本研究旨在阐明奶牛乳腺对小肽的摄取利用及其调控机制,为小肽合理利用提供理论依据,实现提高乳品质的目的。
  1.Met-Met对BMECs乳蛋白合成的影响
  该试验旨在研究Met-Met对BMECs乳蛋白合成的影响及其分子机制。BMECs饥饿处理12h后,使用不同浓度的Met-Met处理BMECs24h,检测其对细胞增殖、细胞活力、细胞周期、乳蛋白合成及mTOR和JAK2-STAT5信号通路中信号因子表达的影响。其次,加入JAK2的抑制剂AG490(50μM)和mTOR抑制剂rapamycine(100ng/mL)处理细胞,检测其对细胞增殖和β-酪蛋白(β-CN)合成的影响。结果发现,Met-Met剂量依赖性的促进β-CN的表达,其最适添加量为80μg/mL。80μg/mL Met-Met的添加显著提高了细胞活力,促进细胞周期从G1期到S期的转变,提高细胞周期蛋白D1的表达,促进JAK2、STAT5、mTOR、S6K1和4E-BP1的磷酸化。抑制JAK2和mTOR后,Met-Met促进细胞增殖和β-CN合成的效果显著下降。研究结果表明,Met-Met通过促进细胞增殖及激活JAK2-STAT5和mTOR信号通路促进β-CN的合成。
  2.小肽转运载体在奶牛乳腺中的表达及其在小肽摄取中的作用
  该试验旨在研究BMECs对模拟肽β-Ala-Lys-AMCA和Met-Met-FITC的摄取机制。首先,检测奶牛乳腺组织中表达的载体种类及其定位。其次,研究BMECs中小肽转运载体对β-Ala-Lys-AMCA和Met-Met-FITC的摄取特性,检测小肽转运载体在乳腺组织中的表达、定位及在不同时间、温度、浓度和添加不同抑制剂的条件下处理BMECs,检测细胞裂解液中β-Ala-Lys-AMCA及Met-Met-FITC的含量。研究发现PepT2和小肽组氨酸转运载体1(PhT1)均在奶牛乳腺组织中表达且主要定位于细胞膜。β-Ala-Lys-AMCA在BMECs中的摄取在前60min呈直线型快速增加,60min后其在细胞内的吸收量达到饱和;Met-Met-FITC的摄取在前15min直线型快速增加,15min后达到饱和。β-Ala-Lys-AMCA和Met-Met-FITC在细胞内的吸收都呈现出浓度依赖性且符合米氏方程(β-Ala-Lys-AMCA:米氏常数为82μM,最大吸收速度为124pmol/min/mg protein;上的表达和β-Ala-Lys-AMCA摄取的影响。在此基础上研究干扰mTOR两种不同类型的复合物mTORC1和mTORC2,检测bPepT2在细胞膜上表达和摄取的变化,及mTORC1/mTORC2干扰对泛素化连接酶Nedd4-2表达的影响,以探究Nedd4-2是否可以调控bPepT2的表达和功能。之后同时干扰mTORC1/mTORC2和Nedd4-2检测BMECs细胞膜上PepT2的表达变化及细胞对β-Ala-Lys-AMCA摄取的影响。结果发现,使用rapamycin抑制mTOR活性可以显著降低BMECs细胞膜上PepT2的表达并抑制细胞对β-Ala-Lys-AMCA的摄取,干扰DEPTOR可显著提高BMECs细胞膜上PepT2蛋白的表达量且促进BMECs对β-Ala-Lys-AMCA的摄取。干扰mTORC1和mTORC2均可显著降低细胞膜上PepT2蛋白的表达并抑制BMECs对β-Ala-Lys-AMCA的摄取。抑制mTORC1能够提高Nedd4-2的表达,而抑制mTORC2对Nedd4-2的表达无影响。使用双重免疫荧光标记和Co-IP试验发现,bPepT2和Nedd4-2存在相互作用,干扰mTORC1显著促进了bPepT2和Nedd4-2的相互作用及bPepT2的泛素化。干扰Nedd4-2显著提高bPepT2在BMECs细胞膜上的表达及β-Ala-Lys-AMCA的摄取。与单独干扰mTORC1相比,同时干扰Nedd4-2和mTORC1能够使bPepT2在细胞膜上的表达和β-Ala-Lys-AMCA的摄取增加,说明同时干扰Nedd4-2和mTORC1时,mTORC1不再能调控bPepT2在细胞膜上的表达和功能。但同时干扰mTORC2和Nedd4-2,bPepT2在细胞膜上的表达及β-Ala-Lys-AMCA的摄取仍显著降低。以上结果提示mTOR可调控bPepT2的表达和活性,mTORC1和mTORC2均是其调控因子,Nedd4-2调控并介导mTORC1对bPepT2表达和功能的调控。
  综上所述,本研究发现Met-Met通过促进细胞增殖和激活JAK2-STAT5及mTOR信号通路促进奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成。bPepT2在BMECs摄取小肽(模拟肽β-Ala-Lys-AMCA和Met-Met)过程中发挥重要作用,其中N-糖基化通过影响其在细胞膜上的表达及细胞内的定位,mTORC1通过Nedd4-2介导影响bPepT2的表达,并最终调控小肽的摄取。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号