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中国被毛孢胞内多糖(HSIPS2)分离纯化、抗氧化活性及结构研究

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摘要

第一章 绪论

1.1 虫草简介

1.1.1 虫草的活性物质

1.1.2 虫草的药理作用

1.1.3 虫草的人工培养

1.2 多糖的生物活性研究

1.2.1 抗氧化活性

1.2.2 抗肿瘤活性

1.2.3 免疫调节活性

1.2.4 降血糖活性

1.3 多糖的结构研究方法

1.4 中国被毛孢多糖研究概况

1.4.1 中国被毛孢多糖的提取、分离及纯化

1.4.2 中国被毛孢多糖的活性研究

1.4.3 中国被毛孢多糖的结构研究

1.5 研究目的、意义和主要内容

1.5.1 研究目的及意义

1.5.2 主要内容

第二章 中国被毛孢胞内多糖(HSIPS2)的分离纯化及抗氧化活性研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 培养基制备

2.2.2 菌种发酵培养

2.2.3 发酵过程中菌丝体生物量及胞内粗多糖含量测定

2.2.4 中国被毛孢胞内多糖的提取

2.2.5 酶-Sevage法脱蛋白和双氧水法脱色素

2.2.6 多糖的分离纯化

2.2.7 多糖分子量及纯度测定

2.2.8 单糖组成

2.2.9 抗氧化活性

2.3 结果与分析

2.3.1 发酵过程中菌丝体生物量及胞内粗多糖含量测定

2.3.2 中国被毛孢胞内多糖的得率

2.3.3 中国被毛孢胞内多糖的分离纯化

2.3.4 分子量及纯度

2.3.5 HSIPS2的单糖组成及摩尔比例

2.3.6 抗氧化活性分析

本章小结

第三章 中国被毛孢胞内多糖HSIPS2初级结构及链构象研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 主要试剂

3.1.2 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 红外光谱分析

3.2.2 甲基化及GC/MS分析

3.2.3 核磁共振光谱分析

3.2.4 HSIPS2在溶液中的链构象

3.2.5 原子力显微镜观察形貌

3.3 结果与分析

3.3.1 红外光谱分析

3.3.2 甲基化分析

3.3.3 核磁分析

3.3.4 链构象分析

3.3.5 HSIPS2在原子力显微镜下的形貌

本章小结

第四章 结论与创新点

4.1 全文结论

4.2 全文创新点

参考文献

硕士期间科研成果

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摘要

中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是从天然虫草中分离得到的虫草菌之一,具有与天然虫草相似的生物活性功能,为我国现代中医药和保健食品的开发提供新的重要原料。而多糖是中国被毛孢的主要活性成分之一,具有很好的药理活性,拥有非常好的应用价值。本实验在培养基中添加陈皮水提物对中国被毛孢菌株(HS001)进行发酵,以得到的中国被毛孢发酵菌丝体为原料,通过分离纯化得到一种新型的胞内多糖,进一步研究表明中国被毛孢胞内多糖具有较高的体外抗氧化活性,并首次对其化学结构进行表征。主要研究过程及结果如下:
  1、中国被毛孢胞内多糖的分离纯化及抗氧化活性研究。(1)在发酵培养基中添加陈皮水提物对中国被毛孢菌株(HS001)进行发酵得到中国被毛孢菌丝体。中国被毛孢发酵菌丝体经过热水浸提、醇沉后得到胞内粗多糖,得率为4.6%;粗多糖进一步脱蛋白、脱色素、过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephacryl S-100凝胶柱色谱分离得到均一性多糖组分(HSIPS2)。(2)采用静态光散射与排阻色谱联用方法(SEC-MALLS)以及高效液相色谱(HPLC)法测定分析中国被毛孢胞内多糖分子信息以及单糖组成。发现HSIPS2的分子量Mw=1.463×104 g/mol,纯度达到99.82%,是一个低分散度、均一性的纯多糖。此外,激光光散射仪测得HSIPS2多糖的均方旋转半径<S2>z1/2为0.5 nm,流体力学半径Rh=2.3 nm; HPLC法测得HSIPS2的单糖组成及摩尔比为:葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0,确定HSIPS2是一种新型多糖。(3)体外抗氧化活性分析得知,HSIPS2多糖具有较高的抗氧化活性。HSIPS2的ORAC值为872.80μmol TE/g;在1.0 mg/mL时,HSIPS2还原能力为0.99;此外,HSIPS2对DPPH自由基清除率、羟自由基清除率以及ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.73 mg/mL、0.75 mg/mL和0.47 mg/mL。
  2、首次深入地对中国被毛孢胞内多糖HSIPS2结构进行研究。(1)经过红外光谱(IR)、甲基化分析以及核磁(NMR)分析发现,HSIPS2多糖的化学结构主要是以1,4糖苷键连接为主链的α-葡萄糖吡喃型残基,支链为O-6位被端基α-Glcp-(1→所取代的1,5糖苷键连接的β-半乳糖呋喃型残基,且支链通过O-6位与主链相连,此外还有少量的1,3糖苷键连接的α-呋喃型核糖、1,4糖苷键连接的α-吡喃型甘露糖和1,2糖苷键连接的吡喃型半乳糖。(2)通过SEC-MALLS-IR-ViscoStarⅡ联用和AFM观测研究HSIPS2多糖的构象,得到α为0.67,v为0.56,ML=334.05 nm-1,q=0.70 nm,d=0.69 nm,表明HSIPS2多糖在0.1 mol/L NaNO3溶液中的构象为柔顺链。此外,HSIPS2多糖在溶液中的链构象经原子力显微镜(AFM)观测得到了进一步证明。本研究为阐明HSIPS2多糖的构效关系提供了理论基础。

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