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锌/镉超积累植物东南景天(Sedum alfredii Hance)两个锌转运蛋白基因的功能研究

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主要缩略词表

第1章 文献综述

1．1 土壤锌、镉污染现状

1．2 重金属超积累植物及其应用

1．2．1 污染土壤的修复

1．2．2 植物提取修复及重金属超积累植物

1．3 重金属超积累作用机制

1．3．1 根际重金属的活化

1．3．2 重金属的吸收与转运

1．3．3 植物体内的重金属区隔和解毒

1．4 金属离子转运蛋白及ZIP家族研究进展

1．4．1 金属离子转运蛋白

1．4．2 ZIP转运蛋白

1．5 本研究背景、意义及内容

第2章 酵母功能互补与异源表达

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 酵母遗传转化

2．2．3 转基因酵母对重金属的耐性分析

2．2．4 转基因酵母对重金属的吸收特征分析

2．2．5 数据统计

2．3 结果与分析

2．3．1 △zrc1异源表达SaZIP2、SaZIP3后对镉的耐性和积累能力研究

2．3．2 ZHY3异源表达SaZIP2、SaZIP3后对锌的耐性和积累能力研究

2．3．3 △smf1异源表达SaZIP2、SaZIP3后对锰的耐性和积累能力研究

2．3．4 DDY4异源表达SaZIP2、SaZIP3后对铁的耐性和积累能力研究

2．4 讨论

第3章 亚细胞定位

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 感受态大肠杆菌制备

3．2．2 遗传转化大肠杆菌

3．2．3 GFP融合载体构建

3．2．4 洋葱表皮定位

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第4章 Zn／Cd胁迫下两种生态型东南景天ZIP2和ZIP3基因表达水平研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 植物的培养及实验设计

4．2．2 植物总RNA的提取及cDNA的合成

4．2．3 q-RT-PCR结果分析

4．2．4 植株生长及锌、镉含量分析

4．2．5 数据统计

4．3 结果与分析

4．3．1 锌、镉处理下东南景天的生长及锌、镉含量分析

4．3．2 Cd处理下两种生态型东南景天ZIP2基因的表达特征

4．3．3 Zn处理下两种生态型东南景天ZIP2基因的表达特征

4．3．4 Cd处理下两种生态型东南景天ZIP3基因的表达特征

4．3．5 Zn处理下两种生态型东南景天ZIP3基因的表达特征

4．4 讨论

第5章 过量表达SaZIP2和SaZIP3基因对拟南芥重金属耐性及积累量的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 植物过表达载体的构建

5．2．2 感受态农杆菌制备

5．2．3 遗传转化农杆菌

5．2．4 拟南芥转基因

5．2．5 转基因植株锌、镉耐性及积累量分析

5．2．6 数据统计

5．3 结果与分析

5．3．1 转基因拟南芥的分子验证

5．3．2 SaZIP2或SaZIP3过量表达对拟南芥Zn／Cd耐性的影响

5．4 讨论

第6章 主要结论、创新点与研究展望

6．1 研究结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

攻读硕士期间主要成果

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摘要

探明超积累植物对重金属超积累作用的生理生化过程和分子机理，不仅有利于植物修复技术的发展和推广应用，而且有助于丰富植物营养学理论，是当前国内外研究热点。超积累生态型东南景天（Sedum alfredii Hance）是我国原生的锌/镉超积累植物，对锌、镉具有很强的耐性和很高的积累量，对其超积累作用的分子机理研究，有望克隆具有自主知识产权的超积累作用相关基因。
　　转运蛋白是一类位于膜上的运输蛋白，广泛参与金属元素的吸收、转运和区隔过程。其中锌铁调节转运蛋白((Z)RT,(I)RT-like(P)rotein，ZIP)广泛存在于细菌、真菌、动物、植物真核生物中，被认为在锌、铁、锰、镉、铜等金属元素的根系吸收、木质部长距离运输以及地上部稳态维持中发挥重要功能。
　　基于转录组测序，本实验室已克隆得到多个超积累生态型东南景天的ZIP家族基因，但其功能尚不明晰。在上述基础上，本论文利用酵母功能互补、洋葱表皮定位、q-RT-PCR、转基因技术等分子生物学方法，系统探究了超积累东南景天中SaZIP2和SaZIP3基因的功能，取得的主要研究结果如下:
　　1、使用醋酸锂酵母转化法，选用野生型DY1457和DY4743、锌镉敏感型突变体△zrc1、锌吸收缺陷型突变体ZHY3、锰吸收缺陷型突变体△smf1、铁吸收缺陷型突变体DDY4分别研究SaZIP2和SaZIP3基因对镉、锌、锰、铁的转运能力。转化SaZIP2和SaZIP3均使锌镉敏感型突变体△zrc1无法在含镉培养基上生长，而对酵母镉积累量没有影响，说明SaZIP2和SaZIP3在质膜而非液泡膜上转运镉;转化SaZIP2和SaZIP均能恢复锌吸收缺陷型突变体ZHY3吸收锌的能力，且转化SaZIP2和SaZIP3后，突变体锌含量分别提高了63.7％和251.4％，说明SaZIP2和SaZIP3均能转运锌，且SaZIP3转运锌的能力大于SaZIP2;转化SaZIP3的锰吸收缺陷型突变体△smf1锰含量较对照提高了13.4％，但并未达到野生型酵母锰含量的水平，说明表达SaZIP3只在一定程度上恢复了突变体吸收锰的功能，而SaZIP2在酵母中不具备转运锰的能力;转化SaZIP2和SaZIP3更加减弱了铁吸收缺陷型突变体DDY4吸收铁的能力，但不影响突变体铁含量。上述酵母功能互补试验说明，SaZIP2和SaZIP3均能介导镉、锌和铁的转运，且SaZIP3能介导锰的转运。
　　2、利用Gateway技术构建GFP融合载体，采用基因枪技术将其导入洋葱表皮细胞，暗培养16h后用激光共聚焦显微镜检测绿色荧光，SaZIP2-GFP融合载体表达产物在细胞质液泡以外的地方呈现点状分布，SaZIP3-GFP融合载体表达产物在细胞膜和细胞核膜上分布，暗示SaZIP2是分布在除液泡膜以外细胞器质膜上的转运蛋白，SaZIP3是分布在细胞质膜和细胞核膜上的转运蛋白。但SaZIP2究竟分布在何种细胞器质膜上，以及SaZIP3分布在核膜上的作用还有待进一步研究。
　　3、采用营养液培养试验，利用q-RT-PCR比较分析了锌/镉处理下ZIP2和ZIP3在两种生态型东南景天(超积累生态型HE，非超积累生态型NHE)中的表达水平，及其与东南景天的锌、镉含量的关系。长时间缺锌处理会增加NHE和HE地上部、根部ZIP2和ZIP3的表达量，加锌处理则有抑制效果，说明ZIP2和ZIP3是高亲和的锌转运蛋白。5μM镉处理NHE24 h和8d，SnZIP2基因在其地上部表达分别上调2倍和7倍，在根部表达分别下调25倍和4倍，说明SnZIP2在地上部能特异性转运锌，在根部还转运镉。HE只在100μM镉处理8d的情况下，地上部SaZIP2表达量显著上调，说明SaZIP2在HE中非特异性吸收锌，还参与了镉从根部到地上部的转运。5μM镉处理NHE24 h和8d，SnZIP3基因在其地上部表达分别上调近5倍和下调近4倍，在根部表达分别上调近6倍和近8倍，说明SnZIP3在NHE中是高亲和且特异性强的锌转运蛋白。镉处理对HE地上部SaZIP3表达有抑制作用，且随着镉浓度的增加，抑制程度加强，低浓度的镉处理对HE根部SaZIP3表达有促进作用，而高浓度的镉长时间处理有抑制作用，说明在HE中SaZIP3非特异性转运锌，还参与了根部镉吸收。
　　4、通过农杆菌介导的方法将SaZIP2和SaZIP3基因过表达载体分别转入模式植物拟南芥中，采用平板和水培的方法观察转基因拟南芥的锌、镉耐性和积累量变化，以验证SaZIP2和SaZIP3基因的功能。过表达SaZIP2或SaZIP3的拟南芥同野生型(WT)在锌、镉处理下根系生长受抑制程度一致，根系长度明显变短，说明它们并不参与锌镉的区隔解毒过程，与它们并不定位在液泡膜上的研究结果相符。50μM ZnSO4处理拟南芥一周，转基因株系间地上部锌含量没有明显差异，均显著高于WT，是WT的90倍多，根部锌含量有同样的趋势，转基因株系根部锌含量相对WT增加25％以上，转基因株系锌转运系数是WT的7倍，说明SaZIP2和SaZIP3参与锌的吸收及向地上部的转运过程。过表达SaZIP2株系的镉转运系数最高，地上部和根部镉含量均高于WT，但差异不显著，过表达SaZIP3的株系地上部和根部镉含量分别是WT的1.5倍和3倍，显著高于WT，但镉转运系数最低，说明SaZIP2参与镉向地上部的转运过程，Sa ZIP3参与镉的吸收过程，这与前文酵母功能互补实验和镉处理时基因表达水平研究所得结论相符，即SaZIP2和SaZIP3特异性不强，除转运锌外，在镉的吸收及转运中也有重要作用。

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