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论文说明
致谢
摘要
第一章 文献综述
1．1 引言
1．2 蛋白质体外复性过程
1．2．1 包涵体的形成
1．2．2 包涵体的分离、纯化与溶解
1．2．3 蛋白质复性机制
1．2．4 蛋白质体外复性方法
1．3 二硫键氧化还原酶DsbA／DsbC及其在协助蛋白质折叠中的应用
1．3．1 蛋白质二硫键的形成
1．3．2 二硫键氧化还原酶Dsb家族蛋白
1．3．3 DsbA的结构和性质
1．3．4 DsbC的结构和性质
1．3．5 DsbA／DsbC在协助蛋白质体内外折叠中的应用
1．4 重组组织型纤溶酶原激活剂变异体——Reteplase
1．4．1 组织型纤溶酶原激活剂
1．4．2 重组组织型纤溶酶原激活剂变异体
1．4．3 Reteplase包涵体的体外重折叠复性研究现状
1．5 本文研究思路及内容
第二章 重组reteplase包涵体制备及稀释复性研究
2．1 引言
2．2 材料与仪器
2．2．1 质粒与菌株
2．2．2 工具酶与试剂
2．2．3 培养基
2．2．4 缓冲液
2．2．5 实验仪器
2．3 实验方法
2．3．1 重组reteplase表达载体的构建
2．3．2 重组质粒鉴定
2．3．3 菌种筛选
2．3．4 菌种保藏
2．3．5 重组reteplase的发酵及诱导表达
2．3．6 重组reteplase包涵体制备及纯化
2．3．7 重组reteplase包涵体的溶解交性及重折叠复性
2．4 分析方法
2．4．1 细胞生长测定
2．4．2 琼脂糖凝胶电泳
2．4．3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2．4．4 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
2．4．5 重组reteplase的活性测定
2．4．6 重组reteplase复性过程的高级结构分析
2．5 结果与讨论
2．5．1 Reteplase表达载体构建与重组质粒鉴定
2．5．2 重组reteplase的发酵
2．5．3 重组reteplase包涵体的分离纯化和溶解
2．5．4 重组reteplase的稀释复性
2．5．5 利用正交试验设计考察高蛋白浓度下reteplase的复性效果
2．5．6 复性reteplase的荧光光谱分析
2．6 本章小结
第三章 固定化DsbA／DsbC协助reteplase包涵体体外复性研究
3．1 引言
3．2 材料与仪器
3．2．1 质粒与菌株
3．2．2 工具酶与试剂
3．2．3 培养基
3．2．4 缓冲液
3．2．5 实验仪器
3．3 实验方法
3．3．1 重组DsbA／DsbC表达载体的构建
3．3．2 重组质粒鉴定
3．3．3 菌种筛选
3．3．4 菌种保藏
3．3．5 重组DsbA／DsbC的发酵及诱导表达
3．3．6 Ni-NTA亲和层析纯化DsbA／DsbC
3．3．7 DsbA／DsbC的固定化
3．3．8 固定化DsbA／DsbC的稳定性测试
3．3．9 固定化DsbA／DsbC协助reteplase体外复性
3．4 分析方法
3．5 结果与讨论
3．5．1 DsbA／DsbC表达载体构建与重组质粒鉴定
3．5．2 重组DsbA／DsbC的发酵
3．5．3 DsbA／DsbC的分离纯化
3．5．4 DsbA／DsbC的固定化及稳定性
3．5．5 固定化DsbA／DsbC协助reteplase体外复性
3．6 本章小结
第四章 固定化DsbC复合层析柱及其协助reteplase包涵体柱上复性研究
4．1 引言
4．2 材料与仪器
4．2．1 实验材料
4．2．2 缓冲液
4．2．3 实验仪器
4．3 实验方法
4．3．1 复合层析复性柱的构建
4．3．2 固定化DsbC复合层析柱协助reteplase柱上复性
4．4 分析方法
4．5 结果与讨论
4．5．1 SEC柱体积对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响
4．5．2 洗脱流速对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响
4．5．3 上样方式对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响
4．5．4 固定化DsbC协助reteplase连续批次柱上复性
4．6 本章小结
第五章 结论与展望
5．1 结论
5．2 展望
参考文献
作者简介
