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磷酸二酯酶5抑制剂通过抑制经典Wnt信号减少骨量的作用及分子机制研究

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Wnt信号通路是生物体内广泛存在的信号通路，人们根据不同的Wnt配体所引发的不同信号通路人为地将其划分为经典Wnt信号通路（也称为Wnt/β-catenin信号通路）和非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路激活时会引起β-catenin蛋白在细胞质内的稳定、积累并进入细胞核，增加下游淋巴样增强因子1(Lymphoidenhancer-binding factor1，Lef1)和T细胞因子(T cell factors，TCF)等转录因子的活性，促进下游基因转录。因此经典Wnt信号通路在生物体的发育过程中扮演着十分重要的角色，尤其在胚胎的骨骼发育和个体的骨量维持方面发挥着至关重要的作用。而非经典Wnt信号通路则被称为不依赖于β-catenin的Wnt信号通路，主要是由小G蛋白参与调控的Wnt/平面细胞极性（Planar cell polarity, PCP）通路和Wnt/Ca2+信号通路。非经典Wnt信号通路主要调控细胞命运、分化和细胞运动，而对于骨骼形成的调控仅有少量最新的研究表明非经典Wnt信号通路也参与调控。
　　磷酸二酯酶(Phosphodieterase，PDEs)是一个多基因大家族，包括了11型共30余种磷酸二酯酶同工酶。PDEs能够水解细胞内的环磷酸腺苷(Cyclic adenosinemonophosphate，cAMP)和环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，从而终结它们作为第二信使所起的信号传导作用。PDEs催化结构域的差异决定了底物的特异性，其中磷酸二酯酶5(Phosphodieterase5，PDE5)只能够特异性的水解cGMP。PDE5抑制剂通过抑制PDE5的活性使其不能发挥水解cGMP的作用，从而升高细胞内cGMP的浓度进而激活cGMP依赖的蛋白激酶G(Protein kinase G,PKG)，引起平滑肌细胞胞浆内钙离子浓度的降低，导致平滑肌的松弛。PDE5在阴茎海绵体血管和肺部动脉壁平滑肌细胞中有很丰富的表达，因此PDE5抑制剂是临床上用于治疗男性勃起功能障碍和肺动脉高压的一线药物。自从第一个PDE5抑制剂西地那非(Sildenafil)开发上市以来，陆续出现了他达拉非(Tadalafil)和伐地那非（Vardenafil）等多个PDE5抑制剂。已有的研究表明PDE5/cGMP/PKG这一信号主要参与调控非经典Wnt信号通路从而对细胞内钙离子的浓度进行调控。但是PDE5是否参与调控经典Wnt信号通路并影响骨量及可能的分子机制尚不明确。
　　本实验研究目的:本课题将通过体外细胞学研究以及整体动物实验，明确PDE5抑制剂是否能够调控经典Wnt信号通路并影响其所支配的骨量维持及具体的分子机制。
　　研究内容及结果:
　　1.PDE5是否参与调控经典Wnt信号通路及对关键蛋白β-catenin的作用。在293T细胞中，通过转染Lef1荧光素酶报告基因并检测其活性，发现他达拉非能够剂量依赖的降低Wnt3a条件性培养基所诱导的Lef1荧光素酶报告基因活性。与此结果一致，当敲降PDE5a时也能够显著降低Wnt3a条件性培养基所诱导的Lef1荧光素酶报告基因活性。进一步通过使用PKG抑制剂KT5823以及敲降PKG2，发现都能够显著增加Wnt3a条件性培养基所诱导的Lef1荧光素酶报告基因活性。对于β-catenin蛋白的作用，通过western blots和免疫荧光发现他达拉非能够降低Wnt3a条件性培养基所诱导的β-catenin蛋白的增加，总蛋白、细胞质与细胞核部分都有显著性的降低。同时通过实时荧光定量PCR，发现他达拉非并不影响β-catenin的mRNA水平。这些结果表明PDE5抑制剂他达拉非参与调控经典Wnt信号，并且能够通过PDE5/cGMP/PKG信号负性调控经典Wnt信号。
　　2.PDE5/cGMP/PKG参与调控经典Wnt信号通路的具体分子机制。首先通过western blots，检测了他达拉非和cGMP类似物8-Br-cGMP作用下，经典Wnt信号通路中的关键激酶即糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase，GSK3β)的活性变化以及由GSK3β所介导的β-catenin在Ser33/Ser37/Thr41位磷酸化水平变化。发现他达拉非和8-Br-cGMP能够显著降低GSK3β的磷酸化水平，说明GSK3β的活性增加，并且增加β-catenin在Ser33/Ser37/Thr41位磷酸化水平，说明其降解增加。与此结果一致，敲降PKG2则显著增加GSK3β磷酸化水平说明其活性下降，并且减少β-catenin在Ser33/Ser37/Thr41位磷酸化水平，说明其稳定性增加。提示他达拉非对经典Wnt信号的调控作用应该是通过GSK3β所介导的。接下来通过使用GSK3β抑制剂SB216763以及GSK3β siRNA，发现他达拉非不能够改变由于抑制GSK3β而引起的Lef1荧光素酶报告基因活性的上升。进一步通过免疫共沉淀发现，PKG2与GSK3β存在着相互作用。所有这些结果表明，由PDE5抑制剂他达拉非所引起的PKG2的激活会进一步激活GSK3β，并增加其介导的β-catenin在Ser33/Ser37/Thr41位磷酸化水平的增加，从而发挥负性调控经典Wnt信号的作用。
　　3.PDE5抑制剂他达拉非对成骨细胞分化的影响。在小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2（此细胞具有向成骨或者成脂细胞分化的潜能）中，他达拉非同样能够减少Wnt3a条件性培养基所诱导的β-catenin蛋白的增加。通过检测成骨细胞marker基因碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）的活性，发现他达拉非能够降低Wnt3a条件性培养基所诱导的AP活性。同时他达拉非能够显著降低成骨细胞的marker基因AP，Ostrix（Osx),Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2，RunⅩ2）以及经典Wnt信号靶基因Lef1和Dkk1的表达。更进一步通过茜素红染色，发现他达拉非能够显著减少细胞矿物化结节的形成。以上结果表明在C3H10T1/2细胞中，他达拉非不仅能够抑制经典Wnt信号，也能够抑制经典Wnt信号所支配的成骨细胞分化。
　　4.他达拉非对于C57BL/6小鼠骨量的影响。口服给予两月龄雌性C57BL/6小鼠不同剂量他达拉非，45 mg/kg和75 mg/kg，每天一次，给药两个月后，通过股骨远端石蜡组织切片的HE染色以及三维重建microCT的分析，发现给予他达拉非的C57BL/6小鼠和对照组小鼠相比骨量明显降低。提取小鼠的骨髓间质于细胞进行培养，通过实时荧光定量PCR以及免疫组化检测成骨细胞marker基因AP和RunⅩ2以及经典Wnt信号靶基因Lef1和Dkk1，发现给予他达拉非后这些基因的表达都显著降低。以上结果说明在整体动物中，他达拉非能够通过抑制经典Wnt信号从而抑制成骨细胞分化进一步导致骨量的降低。
　　5.他达拉非对于分泌型卷曲蛋白1敲降的sFRP1-/-(Secreted frizzled-relatedprotein1，sFRP1)小鼠骨量的影响。sFRP1-/-小鼠由于经典Wnt信号通路的抑制因子sFRP1的敲除导致经典Wnt信号通路的过度激活而出现高骨量的表型，给予他达拉非2个月后，通过股骨远端石蜡组织切片的HE染色以及三维重建microCT的分析，发现给予他达拉非的sFRP1-/-小鼠和对照小鼠相比骨量明显降低，高骨量的表型得到明显的挽回。提取小鼠的骨髓间质干细胞进行培养，通过实时荧光定量PCR以及免疫组化检测成骨细胞marker基因AP和RunⅩ2以及经典Wnt信号靶基因Lef1和Dkk1，发现给予他达拉非后这些基因的表达都显著降低。同时通过茜素红染色发现他达拉非能够显著减少细胞矿物化结节的形成。以上结果说明在sFRP1-/-小鼠中，他达拉非能够挽救由于经典Wnt信号过度激活导致的小鼠高骨量的表型，更加明确他达拉非是够通过抑制经典Wnt信号而发挥降低骨量的作用。
　　结论:他达拉非通过PDE5/cGMP/PKG2信号激活GSK3β，引起β-catenin的降解从而对经典Wnt信号通路进行负性调控，并且抑制成骨细胞分化进一步引起骨量的降低。

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