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透明质酸和羟丙基甲基纤维素对滴眼液常用防腐剂诱导人结膜上皮细胞DNA损伤保护及修复机理研究

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摘要

本文从以下几部分进行了阐述。
　　第一部分常用防腐剂硫柳汞以及过硼酸钠诱导人结膜上皮细胞DNA损伤的研究。
　　目的:
　　硫柳汞(Thimerosal，Thi)是目前临床使用的滴眼液中常添加的防腐剂，过硼酸钠是主要用于人工泪液中的新型氧化型低毒防腐剂。本研究拟探讨硫柳汞和过硼酸钠对体外培养的人结膜上皮细胞DNA损伤、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、细胞存活率的影响。
　　方法:
　　将细胞分为二组，用浓度为0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞和过硼酸钠分别作用于体外培养的人结膜上皮细胞30分钟。应用甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测细胞存活率;碱性彗星实验用于检测以DNA单链断裂(DNA single-strand breaks，SSBs)为主的DNA损伤;用免疫荧光法检测细胞核内磷酸化的H2AX(γH2AX)焦点形成，以评估以DNA双链断裂(DNAdouble-strand breaks，DSBs)为主的DNA损伤情况及严重程度;以乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)为探针，应用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。
　　结果：
　　MTT结果表明，0.001％硫柳汞可导致显著的细胞存活率下降(P＜0.001)。而碱性彗星实验则显示，0.00005％～0.001％的硫柳汞均可导致显著的细胞核SSBs(P＜0.001)。免疫荧光法也发现不同浓度的硫柳汞处理后结膜上皮细胞细胞核内含有γH2AX焦点的细胞比例及焦点数均较对照组显著增加(P＜0.05)，表明硫柳汞可导致细胞核DSBs形成。随浓度的增加，硫柳汞所致的DNA损伤加重。流式细胞仪检测表明，不同浓度硫柳汞处理后的人结膜上皮细胞内ROS水平较对照组增高，差异有显著性(P＜0.001)。与DNA损伤不同的是，0.001％浓度组产生的ROS水平较0.0005％组低，这可能和细胞生存率的下降有关。而过硼酸钠作用于人结膜上皮细胞30分钟后细胞生存率无变化，0.001％浓度组可引起明显DSBs和SSBs，且可引起细胞内ROS水平增高，过硼酸钠在各个浓度组引起的ROS水平升高均小于硫柳汞。
　　结论：
　　硫柳汞可导致人结膜上皮细胞细胞核DNA损伤并影响细胞活性。硫柳汞所致的细胞内ROS增加可能与DNA损伤相关。过硼酸钠不影响细胞生存率，高浓度可引起DNA损伤以及细胞内ROS水平增高，过硼酸钠对结膜上皮细胞的DNA毒性小于硫柳汞。
　　第二部分透明质酸和羟丙基甲基纤维素对硫柳汞所致人结膜上皮细胞DNA损伤抗氧化保护作用的研究。
　　目的：
　　透明质酸(hyaluronan，HA)以及羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)是广泛应用于眼科临床治疗干眼症患者所用的人工泪液替代物。本研究拟探讨HA以及HPMC对硫柳汞引起的对体外培养的人结膜上皮细胞DNA损伤、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、细胞存活率下降的保护作用。
　　方法：
　　将细胞分为3组，一组采用浓度分别为0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞单独处理30min，另两组分别用0.3％ HA或者0.3％ HPMC预处理30分钟再给予相同的硫柳汞处理。用MTT法检测细胞存活率，碱性彗星实验和免疫荧光法检测细胞核内磷酸化的H2AX(γH2AX)焦点检测DNA损伤，以乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)为探针，应用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。
　　结果：
　　MTT结果表明，使用0.001％硫柳汞处理30分钟后，细胞生存率出现明显下降。各个浓度引起的DNA单链或双链断裂以及细胞内ROS水平升高基本呈剂量效应，然而，细胞用0.3％ HPMC或0.3％ HA预处理30分钟后，与单独硫柳汞处理组比较，可以显著提高细胞生存率，降低DNA损伤以及细胞内ROS水平，且HA的抗氧化细胞保护作用要优于HPMC。
　　结论：
　　硫柳汞可引起角膜上皮细胞DNA损伤，氧化应激可能为其机制。HA以及HPMC具有抗氧化作用，可抑制硫柳汞引起的DNA损伤，从而可在泪液替代成分的作用之外发挥眼表保护作用，且HA的保护作用要优于HPMC。
　　第三部分硫柳汞急性暴露所致人结膜上皮细胞DNA损伤修复机理的研究。
　　目的：
　　在前期的实验中，已证实硫柳汞短期暴露可引起眼表上皮细胞DNA损伤以及ROS产生增加。本研究拟检测给予细胞24h修复后的细胞凋亡、细胞周期分布、线粒体膜电位以及相关靶蛋白的表达，探讨硫柳汞急性暴露后细胞的DNA损伤修复机制。
　　方法：
　　将细胞先用0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％硫柳汞处理30min之后洗去药液，换上新鲜培养基连续培养24h后，检测细胞形态以及细胞生存率、用流式细胞仪检测细胞周期分布，细胞凋亡，线粒体膜电位，用western blot检测凋亡蛋白PARP、Caspase3以及自噬蛋白LC-3的表达情况。
　　结果：
　　用硫柳汞处理30min后，并未引起明显的细胞凋亡，而在24h修复后，0.0005％-0.001％组却出现了明显的细胞凋亡(p＜0.001)，流式细胞仪检测显示处理30min后0.0005％-0.001％组线粒体膜电位出现明显下降(p＜0.001)，24h后细胞周期出现了G2M期阻滞，Western blot结果显示凋亡标志蛋白PARP以及caspase3出现活化片段，自噬标志蛋白LC-3也出现了活化片段。
　　结论：
　　低浓度硫柳汞短期暴露引起的DNA损伤可修复，高浓度硫柳汞短期暴露引起的DNA损伤是不可修复的，通过细胞周期阻滞可引起细胞死亡，可能是通过Caspase介导的细胞凋亡途径，另外，自噬这种死亡方式也可能被激活。

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