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番茄中的两个MAPKs和拟南芥中的一个MAPKKK在抗性反应调控中的功能分析

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摘要

植物促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶。他与其他一些信号分子组成MAPK级联信号通路,接受外界刺激信号,将信号传入细胞内,影响特定基因的表达,从而在植物的生长、发育、分化、凋亡,生物抗性及非生物抗性等多方面起着重要的作用。在众多植物中,拟南芥中MAPKs的功能研究的最为详细,尤其是在环境胁迫和激素调控应答中的作用。在已完成的拟南芥全基因组测序工作中就已经鉴定出20种MAPK,10种MKK和60种MKKK。但是大多数研究的重心还是集中在MAPK和MKK上。在本研究中,我们将对番茄的2个MAPK基因SlMPK4和SlMPK6和拟南芥中的MKKK基因raf43在生物胁迫和非生物胁迫中的功能进行研究。
   目前,通过与拟南芥序列的比对,人们在番茄中已经发现了16个MAPKs。本课题研究了番茄中的两个MAPK基因SLMPK4和SLMPK6在生物胁迫和非生物胁迫上的作用。研究结果表明,当用灰霉菌(Botrytis cinerea)处理番茄后,SlMPK4的转录活性得到了提高。当用VIGS的方法沉默番茄植株(TRV-SLMPK4)的SlMPK4基因后增强了番茄植株对灰霉病菌的感病性。同样的,SlMPK6基因被沉默后,与对照相比也表现出对灰霉病菌更加感病的表型。此外,研究还发现与对照相比,TRV-SlMPK4的抗旱能力也得到了增强。在拟南芥中与番茄SlMPK4和SlMPK6同源的的基因是AtMPK4,虽然人们对AtMPK4的功能已有所了解,但是对AtMPK4在抗病中的作用还未知。所以,我们构建了地塞美松诱导型AtMPK4的基因敲除载体pINDEX3-AtMPK4,并将其转入拟南芥植株得到pINDEX3-AtMPK4突变体植株,研究发现,当用灰霉病菌处理时,pINDEX3-AtMPK4突变体比对照植株更加感病,而且有趣的是,pINDEX3-AtMPK4植株与对照植株相比,增强了对干旱胁迫的抗性,表明AtMPK4在拟南芥中负调控植物的抗旱性。以上结果我们又在使用定量PCR的方法分析AtMPK4在被灰霉病菌、干旱胁迫和茉莉酸(JA)处理后基因的表达情况,以及抗病相关基因SlPR1a和SlPR1b的表达情况时所进一步得到证实。以上结果均表明,SlMPK4和SlMPK6在番茄的抗病和干旱胁迫下扮演者重要的角色。
   研究发现,拟南芥基因组编码了60个MAPKKKs,而且这些基因在植物的生长发育和抗性胁迫上都起着非常重要的作用。这些基因可以被分成了2个组:MEKK类型和Raf-like。其中对拟南芥中的Raf-like激酶的功能还知之甚少,只有少数被报道在胁迫反应上有一定的作用,包括CTR1(constitutive triple response),MAPKKK EDR1(enhanceddisease resistance1),group B Raf-like kinase At1g73660,group C ATN1。在本研究中,我们克隆并鉴定了一个拟南芥Raf-like家族激酶基因raf43。基因表达谱分析表明它参与了植物早期的抗性反应。Raf43的拟南芥T-DNA敲除突变体与对照相比表现出了对各种胁迫,如活性氧、干旱胁迫、盐胁迫,的更加敏感性。但是,有趣的是,过表达raf43的拟南芥植株只是表现出了对methyl Viologen(MV)的更高抗性和对干旱胁迫的敏感性。在对其他胁迫的的反应上,如渗透胁迫、激素ABA处理以及盐胁迫,与对照几乎没有区别。此外,通过酵母双杂交的方法,我们还发现raf43并不能与拟南芥的任何一个MAPKK互做。总之,raf43对拟南芥在不同的胁迫下的反应或起着正调控作用或起着负调控作用。

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