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家蚕(Bombyx mori)5龄幼虫脂肪体蛋白质组及其相关功能基因的研究

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家蚕作为一种重要的经济昆虫,不仅是鳞翅目昆虫的典型模式生物,而且也是开发新一代生物反应器的重要材料。脂肪体是家蚕体内蛋白质合成的工厂,能贮存营养,解毒以及为生命周期活动提供各种生物合成的代谢产物,具有类似哺乳动物肝脏和肾脏的功能。5龄期是家蚕由幼虫转变成蛹的过渡时期。5龄期脂肪体组织生长发育速度非常快,远远快于蚕体生长速度,组织细胞形态和功能都随着生长发育而发生显著变化,是研究昆虫生长发育的理想模式组织。
　　 蛋白质组学是在蛋白质水平上大规模研究基因表达的新手段,通过对不同组织或同一组织在不同发育阶段的蛋白质表达图谱进行研究比较,能够直接的研究蛋白质的表达水平和相关蛋白的活性状态,从而发现一些有意义的功能蛋白。本研究利用双向电泳技术和质谱鉴定技术相结合的方法,从蛋白质组学水平研究5龄期脂肪体基因表达的变化规律,为家蚕生长发育机制研究提供基础。主要研究结果如下:
　　 1构建了家蚕5龄期脂肪体蛋白质双向电泳图谱。本研究经过多次重复实验,优化实验条件,分别建立了家蚕5龄1天、3天、5天、7天脂肪体双向电泳图谱。凝胶背景清晰,蛋白点分离较好,可以检测到600个以上蛋白点,蛋白点主要分布在分子量25～85kD,等电点pH4～8范围内,达到了实验设计的要求。
　　 2不同发育时期脂肪体差异蛋白比较分析及质谱鉴定。本实验利用Imagemaster2D软件对家蚕5龄1天与5龄7天脂肪体蛋白质图谱进行差异蛋白分析,5龄1天648个蛋白点以及5龄7天626个蛋白点中。差异表达分析发现表达量大于2倍的差异蛋白:5龄1天有28个,5龄7天有52个,其中在5龄7天新出现的特异蛋白点有26个,这些差异蛋白的出现,显示了家蚕5龄期脂肪体细胞形态与功能的变化。为了进一步研究这些差异蛋白的功能,我们在5龄7天电泳图谱中选取40个特异表达蛋白点进行胶内酶解和MALDI-TOF-MS鉴定,共成功鉴定24个蛋白斑点,其中包括:3个分子伴侣蛋白如蛋白点1、37和38分别鉴定为heat shockprotein70kD(热休克蛋白)、heat shock protein21.4和heat shock protein19.9;3个与代谢途径相关的酶类如蛋白点8鉴定为ATP synthase beta subunit(ATP合酶亚基),蛋白点23鉴定为pyridoxal kinase(吡哆醛激酶),蛋白点32鉴定为peptidylprolylisomerase B(肽基脯氨酰异构酶);2个在昆虫免疫方面起作用的蛋白,包括蛋白点31鉴定为Glutathione S-Transferase Sigma(谷胱甘肽硫解转移酶),蛋白点34鉴定为Thiol peroxiredoxin(巯基蛋白过氧化酶);鉴定了3个家蚕特有的30K蛋白;鉴定获得了在真核生物体内具有重要功能的Calreticulin(钙网蛋白);此外,本实验还鉴定了一些重要的结构蛋白,例如Ribosomal protein SA,Ribosomal protein P0,Actin等。
　　 3真核翻译起始因子(Eukaryotic translaTiO2 initiaTiO2 factors,eIFs)是一类在蛋白质翻译起始过程中调控蛋白质合成的重要因子。在已经发现的翻译起始因子中,eIF3是组成最复杂的一个,在蛋白质翻译起始过程中起着核心作用。研究eIF3在蛋白质翻译起始中的调控机制对于阐明家蚕体内蛋白质合成重要器官的脂肪体组织的功能变化规律具有重要意义。本实验利用电子克隆、3'RACE(3'rapidamplificaTiO2 of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因eDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQS685301)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1009bp,由870bp的开放阅读框序列(ORF),55bp的5'端非翻译区序列(5'-UTR)和65bp的3'端非编码区序列(3'-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列分析显示,家蚕 eIF3f与其他物种的 eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN(JunactivaTiO2 domain binding protein-Mpr1-Pad1 N-terminal)结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5'调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异。

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