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农药残留ELISA速测试剂盒产业化技术研究——三唑磷、克百威ELISA试剂盒研制

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致谢

第一章前言

1农药残留生物快速测定方法概述

1.1活体生物测定方法

1.2酶抑制测定方法

1.3免疫测定方法

2免疫测定技术在农药残留检测中的应用现状

3三唑磷、克百威ELISA试剂盒研究现状

4立题依据

4.1开展ELISA产业化技术研究,是我国经济与社会发展的迫切需要

4.2本课题得到了有关单位和基金的资助

4.3开展农药ELISA研究,本研究所具有扎实的研究基础

4.4三唑磷、克百威农药在农业生产中的应用现状

第二章三唑磷、克百威ELISA试剂盒研制

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1半抗原的设计与结构鉴定

2.2人工抗原的鉴定与结合比测定

2.3腹水效价测定

2.4 ELISA条件优化

2.5样品基质影响试验

2.6添加回收率试验

2.7样品各浓度处理组板内、板间ELISA测定值精密度统

2.8处理组板内、板间ELISA测定值显著性检验

2.9样品本底值及实际最低检测限设定

3定性、定量判定方法

4试剂盒构建

5试剂盒比对与验证

5.1与仪器比对

5.2不同实验室比对试验

第三章ELISA试剂盒的产业化

1 ELISA试剂盒产业化生产的技术规程和技术要点

1.1克百威、三唑磷半抗原中试合成工艺

1.2半抗原-蛋白质偶联物制备工艺

1.3单克隆抗体的生产制备工艺

1.4酶和底物的选择

1.5 ELISA操作方法的标准化

2试剂盒生产企业标准(拟)

3 ELISA试剂盒生产成本核算和投资概算

3.1 ELISA试剂盒生产成本核算(元/盒)

3.2 ELISA试剂盒生产(设备)投资概算

4试剂盒生产的“三废”排放情况

5试剂盒生产工艺流程

6市场分析预测

6.1市场容量分析

6.2速测试剂盒的主要用途及用户分析

6.3风险预测

第四章总结与讨论

1取得的成果

2不足与展望

3 讨论

3.1分子模拟方法在农药半抗原合理化设计中是一种重要的探索思路

3.2统计检验分析是农药ELISA试剂盒产业化开发的重要环节

3.3保存期是试剂盒产业化开发的重要条件

参考文献

在校期间发表的文章

在校期间申请的国家发明专利

附件1

附件2

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附件7

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附件9

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摘要

本研究以农药三唑磷及克百威为研究对象,采用分子模拟方法对其半抗原分子进行了设计并合成得到了两种优化的三唑磷半抗原两种半抗原。一乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-基),N-(3-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(T-HBu)、O-乙基,O-[1-苯基-(H-1-2-4-三唑-3-基),N-(5-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THHe)和一种克百威半抗原4-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)。上述半抗原分别与载体蛋白偶联制备成人工抗原,免疫小白鼠,再采用杂交瘤技术制备出了对应单克隆抗体。经测定,抗体(腹水)的效价均在10<'6>以上,与对应农药的结构类似物的交叉反应率均较低,表现出很高的特异性。 在此基础上,通过对固相载体、包被缓冲液、有机溶剂、包被条件、洗涤次数、酶的种类、封闭物种类、点板时间、工作浓度、稳定剂以及不同ELISA模式等因素的筛选比较,优化了三唑磷和克百威ELISA方法和条件。优化后结果显示:Costar酶标板(美国)吸附效果和均一性较好:抗体以PBS(PH 7.4,0.01M)作为包被介质较为理想,人工抗原则以CBS(pH 9.5,0.05M)作为包被介质较为理想:包被条件以在37℃下包被2h效果为佳;反应介质加入2%牛奶可减少非特异性吸附,提高检测灵敏度:有机溶剂中甲醇对ELISA反应的影响较小,反应体系中最终含量10%为佳:HRP酶作为显色反应的催化剂比AP酶更为理想:包被抗原直接竞争ELISA模式OD值的平行性不如包被抗体直接竞争ELISA模式的好;优化出的稳定剂可使包被在酶标板上的抗体在37±1℃条件下保存14天而抗体活性基本保持不变。 利用优化后的分析条件,建立了农药三唑磷异源直接竞争ELISA方法(包被抗体模式)和克百威直接竞争ELISA方法(包被二抗模式)。在考察了不同样品基质对ELISA方法的影响后,进一步对蔬菜样品、水果样品、水、土等环境样品进行了三唑磷和克百威添加回收率试验,检测结果进行了统计分析,考察了方法的准确度与精密度,并对不同处理组间、相同处理组板间的检测数据进行了显著性检验,确定了不同样品的方法本底值、最低检测限及检测结果阴性/阳性判定方法,最终构建了三唑磷ELISA快速测定试剂盒和克百威ELISA快速测定试剂盒。结果表明,三唑磷ELISA方法的检测灵敏度达到了2.66 ng/mL(检测线性范围为1.95-2000ng/mL),克百威ELISA方法的检测灵敏度为0.97 ng/mL(检测线性范围为0.8-340ng/mL),实际样品中的最低检测限达到或接近(部分超过)了一些国家和地区的残留限量(MRL)标准。 通过本课题的研究,在国内外首次研制出了三唑磷半抗原、抗三唑磷单克隆抗体及其ELlSA试剂盒;在国内首次研制出了抗克百威单克隆抗体及其ELISA试剂盒;在国内首次系统建立了农药等小分子化合物ELISA快速测定试剂盒国产化生产的技术体系。试制的试剂盒产品经农业部农药检定所、农业部环境质量监督检验测试中心(天津)、等5家权威检测机构应用,证明该技术可靠,产品质量和性能稳定,可用于指导生产。

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