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纳米载铜硅酸盐对水产病原菌的吸附、杀菌活性及其在罗非鱼上的应用效果与机理研究

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引言

第一章文献综述

第二章CSN对水产病原菌的吸附性能及其机理研究

第三章CSN的抗菌活性及其机理研究

第四章CSN对嗜水气单胞菌粘附罗非鱼上皮细胞的影响

第五章CSN对尼罗罗非鱼生长、微生态、消化和免疫机能的影响

第六章CSN对尼罗罗非鱼养殖水体水质和菌群的影响

第七章小结、创新点和后续研究展望

参考文献

发表或录用的与学位论文相关的论文及授权或申请的专利

致谢

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摘要

长期使用抗生素和抗菌药物，造成诸如细菌抗药性、耐药基因转移、水产品中药物残留等不良后果，直接或间接威胁人类健康，而且由于长期滥用抗生素引起水环境污染，导致养殖环境恶化，生态平衡失调。因此，开创新的科研途径，研发安全无公害的新型抗菌材料已迫在眉睫。 采用纳米无机材料为载体，担持抗菌金属离子而制成的金属系纳米无机抗菌材料，具有稳定性好、不易使细菌产生耐药性、作用持久，使用安全等优点。层状硅酸盐材料MMT的结构、化学键、类质同像代替、层间域与层电荷、阳离子交换等本质属性决定了MMT的纳米属性。MMT纳米属性是纳米化处理与加工的基础。本课题以MMT为材料构建纳米硅酸盐(Layer silicate Nanoparticle，LSN)；从水产病原菌电性、疏水性和细胞膜的特异性着手，对纳米硅酸盐进行改性以提高其对水产病原菌的吸附选择性；在此基础上，在硅酸盐纳米材料上负载具有抑菌作用的铜，构建了纳米载铜硅酸盐(Cu-loaded silicate Nanocomposite,CSN)，并在以下几个方面开展研究：(1)以LSN为对照，研究CSN的结构；CSN的吸附、杀菌活性和机理：CSN对嗜水气单胞菌粘附罗非鱼上皮细胞的阻断作用及其对嗜水气单胞菌粘附引起鱼上皮细胞膜损伤的影响；(2)以LSN、硫酸铜和黄霉素为对照，研究CSN对罗非鱼的应用效果和机理；(3)通过罗非鱼养殖15天不换水试验，研究CSN对养殖水体水质和菌群的影响。 主要研究结果如下： 1.CSN的平均粒径为41nm。CSN所载铜主要是以水合或复合阳离子的形式，以 离子交换的方式进入硅酸盐晶格层间，还有少量铜以化学吸附的形式进入Si-O 四面体和Al-O八面体的微孔中，所载铜可降低硅酸盐所带负电荷的密度，这 有助于CSN与细菌间的静电吸附作用。与LSN相比，CSN的外比表面积、孔 体积和孔径增大，而总比表面积、微孔比表面积、微孔体积则减小。 2.CSN的Zeta电位随pH升高(pH值2～10)而增大，当pH=4.8时，Zeta电位从 负值转变为正值；LSN、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌的Zeta电 位随pH升高而降低。当pH=6时，材料和细菌的Zeta电位均随离子强度的 增大而增大。 3．体外吸附试验表明：在pH为6.0、离子强度为0.01 mol／LNaNO<,3>的条件下， CSN在120 min左右达到吸附平衡，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、荧光假单 胞菌的平衡吸附率分别为96.6％，94.4％，99.4％；而LSN在60 min左右达到 吸附平衡，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌的平衡吸附率分别为 42.1％，37.4％，46.5％。pH和离子浓度对细菌吸附率影响的结果表明：CSN对 细菌的吸附率先随pH的增加而减小，然后到pH=4.8时又逐渐增大，LSN对 细菌的吸附力随着pH的增加而逐渐减小；LSN和CSN对细菌的吸附率均随 着离子强度的增加而降低。 4．体外抗菌试验表明：CSN对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌的最小 杀菌浓度分别为600、600、300 mg／L，而LSN未显抗菌活性。CSN对细菌胞 内酶活性影响结果显示，CSN可使细菌细胞膜发生损伤或通透性增大，导致细 菌胞内酶的外漏。CSN对细菌呼吸代谢影响的结果表明，CSN可抑制三羧酸循 环途径。原子力显微镜动态观察CSN作用下嗜水气单胞茵形态变化的结果发 现，CSN能破坏细菌细胞膜而产生杀灭效果。 5．CSN对嗜水气单胞菌粘附罗非鱼上皮细胞影响的结果显示：CSN显著降低了嗜 水气单胞菌对鳃、皮肤和肠上皮细胞的粘附率；嗜水气单胞茵粘附鱼上皮细胞 后胞浆游离钙、细胞膜磷脂酶A<,2>活性，细胞外LDH含量和细胞损伤率(膜通透 性)、肠上皮细胞膜荧光偏振度和膜脂微粘度(膜流动性)显著增加；CSN可显著 降低由于嗜水气单胞菌粘附鱼上皮细胞引起的细胞膜损伤。 6．选取平均体重为3.9 g的健康尼罗罗非鱼，饲喂含0.15％CSN的日粮56天，发 现CSN显著提高了罗非鱼的生长性能和存活率。进一步研究得知，CSN显著 降低肠道细菌数量，并明显改变肠道菌群的组成，使气单胞菌属，假单胞菌属， 黄杆菌属，不动杆菌属，产碱菌属，肠杆菌科，弧菌属的百分比减少；显著提 高白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性、红细胞C<,3b>受体花环百分率； 显著提高各肠段绒毛和微绒毛高度；显著提高肠组织蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 活性和饲料养分的表观消化率。与黄霉素组相比，CSN组罗非鱼日增重、特定 生长率、肠组织淀粉酶和脂肪酶、中肠微绒毛高度显著提高，在其他指标上均 具一定的优势，但差异不显著。结果提示：CSN通过抑制肠道病原菌的增殖， 提高机体的非特异性免疫机能，改善肠粘膜形态结构，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化，从而提高罗非鱼的生长性能和存活率。7．选取平均体重为43.5g的健康尼罗罗非鱼，饲喂含0.15％CSN的日粮15天， 试验期间不换水，发现CSN显著提高了罗非鱼的生长性能和存活率；降低水 体氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和COD<,Mn>；使水体细菌数量显著降低，并使水 体菌群组成发生了变化，使气单胞菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，产碱菌属， 肠杆菌科的百分比减少。结果提示：CSN通过提高饲料利用效率，降低排入水 域环境的饲料比例，从而改善养殖水体水质；饲料在水体中溶出的CSN或者通过粪便从罗非鱼体内排出的CSN仍然具有较高的杀菌活性。 综上所述，CSN的抗菌机理是基于纳米硅酸盐的吸附性能和Cu<'2+>的杀菌活性，更重要的是，CSN能破坏细菌细胞膜而产生杀灭效果；CSN能有效抑制肠道病原菌的增殖，阻断病原菌与肠上皮细胞的粘附，保护肠粘膜免受病原茵的侵袭，使肠粘膜始终处于健康状态，以益于消化酶的分泌和饲料养分的消化，并提高机体的非特异性免疫机能，从而提高罗非鱼的生长性能和存活率；CSN通过提高饲料利用效率而降低水产养殖的“内源性污染”，改善养殖水体水质；饲料在水体中溶出的CSN或者通过粪便从罗非鱼体内排出的CSN仍然具有较强的杀菌活性，能产生明显的净化养殖环境的效果。

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