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壳聚糖酶解及降解产物的分析与应用

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摘要

1前言

1.1壳寡糖的概述

1.2壳寡糖的制备方法

1.2.1化学降解法

1.2.2物理降解法

1.2.3酶降解法

1.3壳寡糖的应用

1.4壳聚糖酶的研究进展

1.4.1壳聚糖酶的定义及分类

1.4.2壳聚糖酶的来源及性质

1.4.3壳聚糖酶活力测定方法

1.4.4壳聚糖酶的提纯方法

1.5课题的研究背景及意义

1.6本课题的研究内容

2材料与方法

2.1.1菌种来源

2.1.2主要实验材料与药品

2.1.3主要实验仪器与设备

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1壳聚糖酶的分离纯化

2.2.2壳聚糖酶解条件的优化

2.2.3壳聚糖酶解产物的分析

2.2.4壳聚糖酶解产物的应用

3结果与讨论

3.1.1壳聚糖酶酶活的测定

3.1.2蛋白质含量标准曲线的测定

3.1.3硫酸铵盐析曲线

3.1.4 DEAE Cellulose 52离子交换层析

3.1.5壳聚糖酶纯化

3.1.6 SDS-PAGE检测蛋白纯度

3.2.1 pH值对还原糖产量的影响

3.2.2温度对还原糖产量的影响

3.2.3底物浓度对还原糖产量的影响

3.2.4酶解时间对还原糖产量的影响

3.2.5响应面法优化壳聚糖酶解条件

3.3壳聚糖酶解产物的分析

3.3.1壳聚糖酶解产物的红外光谱扫描

3.3.2壳聚糖酶解产物的薄层层析

3.3.3壳聚糖酶解产物最佳吸收波长的测定

3.3.4酶解产物的ESI-MS分析

3.3.5壳聚糖酶解产物的数均分子量测定

3.4壳聚糖酶解产物的应用

3.4.1壳聚糖酶解产物清除·OH自由基的研究

3.4.2壳聚糖酶解产物抗氧化性研究

3.4.3壳聚糖酶解产物金属螫合功能研究

4结论

4.1文章结论

4.2本文创新点

4.3不足之处

5 展望

参考文献

7攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢

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摘要

壳聚糖及其降解产物具有无毒性、生物相容性和生物可降解性等优良特性,在食品、农业、环境、组织工程和生物医药等方面有着广泛的应用。目前壳聚糖专一性酶大多数属于诱导酶,基因表达大多受阻遏物/诱导物系统控制,降解产物为阻遏物,限制壳聚糖的酶解。本论文以蜡状芽孢杆菌为出发菌株制备组成型壳聚糖酶,并对壳聚糖酶解过程及其产物进行研究。通过硫酸铵分级盐析、DEAE Cellulose52离子交换层析将壳聚糖酶进行分离纯化,获得电泳纯的壳聚糖酶相对分子量约为43KDa,回收率为63.07%,比活力提高至50.27U/mg。采用单因素和响应面试验对壳聚糖的酶解条件进行优化,确定最佳酶解条件为:pH5.6、温度为50℃、壳聚糖浓度为2%,酶解时间为150min,此时糖含量为7.7039mg/mL。对比壳聚糖与其酶解产物红外光谱特征吸收峰,可知壳聚糖的降解反应是β-(1,4)糖苷键的断裂过程。经薄层层析测定壳聚糖酶解产物中包含五种不同聚合度的寡糖成分,且不含氨基葡萄糖,说明该酶以内切的方式降解壳聚糖。并通过全波长扫描,确定酶解产物在304nm处有最佳吸收峰。将酶解产物经ESI-MS分析,该物质在304nm定点波长处存在五个吸收峰与薄层层析结果一致。分析各吸收峰的质谱图,推测酶解产物的成分为:N-乙酰氨基葡萄糖、二乙酰基壳三糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖。通过对比发现壳聚糖酶解产物对·OH自由基和过氧化物的清除能力远高于壳聚糖。将酶解产物与金属离子Zn2+、Cu2+的螯合物进行红外光谱扫描,结果表明该产物主要是通过分子内的羟基、氨基和乙酰氨基三个活性官能团与Zn2+和Cu2+发生配位反应。

著录项

  • 作者

    李燕;

  • 作者单位

    天津科技大学;

  • 授予单位 天津科技大学;
  • 学科 发酵工程
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 赵华;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类
  • 关键词

    壳聚糖; 酶解; 降解产物; 分析;

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