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解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的发酵工艺优化、纤溶酶的酶学性质及基因克隆

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1 绪论

1.1 蛋白酶的简介

1.2 丝氨酸蛋白酶

1.3 产蛋白酶菌株发酵工艺优化的研究

1.4 蛋白酶的分离纯化和酶学性质的研究

1.5 蛋白酶的应用研究

1.6 本课题的立题依据、研究内容与意义

2 蛋白酶产生菌的筛选和鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 菌株的多相分类学鉴定

2.4 实验结果与分析

2.5 本章小结

3 蛋白酶及抑菌活性的发酵工艺优化

3.1 实验材料

3.2 测定方法

3.3 发酵工艺优化的方法

3.4 实验结果与分析

3.5 本章小结

4 蛋白酶的分离纯化与酶学性质的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 本章小结

5 Bacillus amyloliquefaciens sp. F1所产胞外蛋白酶的基因克隆及序列分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果与分析

5.4 本章小结

6 总结及展望

6.1 全文总结

6.2 展望

参考文献

附录

致谢

硕士期间主要科研成果

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摘要

蛋白酶是酶学研究中较早也是最深入的一种酶，在生物体内催化各种代谢途径中的生化反应。蛋白酶在洗涤剂、食品发酵、医药卫生、皮革、丝绸纺织等方面有着广泛的应用，占全球酶制剂市场销售量的60％。其中微生物因其生长迅速、易于人工遗传改造，生产的蛋白酶类资源丰富，同时所产的蛋白酶以分泌型为主，在微生物培养过程中直接分泌到胞外，适合工业化的生产需求，所以微生物蛋白酶是蛋白酶的主要来源。本文对产蛋白酶菌株进行了筛选、菌种鉴定，菌株产蛋白酶及抑菌活性物质的发酵工艺优化，蛋白酶的分离纯化、酶学特性及基因克隆等方面的系统研究。
　　首先从深海5000 m的海泥样品筛菌，经过平板初筛和发酵复筛得到了一株蛋白酶酶活比较高的菌株F1，并对其进行形态结构、生理生化特征、API鉴定系统实验等分类鉴定，以及16S rDNA分子生物学鉴定，确定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌，将其命名为Bacillusamyloliquefaciens sp. F1。
　　通过单因素实验，研究了碳源、氮源、碳氮源浓度、种龄、接种量、培养基初始pH、培养基装液量对菌株产酶的影响，确定最优发酵工艺为：最佳氮源及浓度为豆粕2%，最佳碳源及浓度为玉米粉4%，最佳初始pH为10，最佳种龄和接种量分别为20 h和2%，菌株F1在此优化后的条件下发酵培养48 h后，酶活达到2246.65 U/mL，比未优化前其产蛋白酶的酶活提高了9.7倍。
　　采用PEG20000浓缩、Tris-HCl（pH9.0）缓冲溶液透析及阴离子交换层析进行蛋白酶的分离纯化。经过阴离子交换层析（Q-Sepharose-Fast-Flow）分离得到蛋白酶PF1，该酶水解明胶的酶活为1683.91 U/mL，水解胶原蛋白的酶活为1784.47 U/mL。以酪蛋白为底物，研究蛋白酶PF1的酶学性质，该蛋白酶的最适反应温度为60℃，在50～70℃之间，该酶的相对酶活均高于95%，80℃时，相对酶活降到28.47%，该酶比较耐高温。该酶的最适反应pH为10.5，在pH7～11范围内，相对酶活均在80%以上，在pH12的强碱性条件下酶活依然有42%的残留，该酶属于碱性蛋白酶。温度稳定性方面，酶液在40℃环境中稳定性很好，放置2 h后，残留酶活仍保持在70.2%；酶液在50℃环境中的稳定性较好，放置1 h后，残留酶活仍为62.1%；60℃中酶液不稳定，放置10 min后，残留酶活降到30%。金属离子对蛋白酶活性的影响结果表明：在离子浓度为2 mM时，Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+对酶活影响不大，其中Mn2+略有促进作用，相对酶活为107.68%；在离子浓度为10 mM时，Mn2+促进酶活作用明显，相对酶活为152.3%，Zn2+对酶活有一定的抑制作用，相对酶活为81.3%。抑制剂对蛋白酶活性的影响方面，PMSF强烈抑制该蛋白酶的酶活，1 mM PMSF作用下，该酶即失活，该酶属于丝氨酸蛋白酶；EDTA在5 mM浓度时，相对酶活为87.38%，对酶活有一定的抑制作用；o-P对蛋白酶活性基本没有影响，该酶不属于金属蛋白酶。阴离子表面活性剂SDS对该酶有强烈的抑制作用，0.1%的SDS使该蛋白酶的相对酶活降至71.31%，浓度为1%时，该蛋白酶的相对酶活降至13.18%。较高浓度的非离子型表面活性剂Triton X-100、Tween80对该蛋白酶的酶活有一定的抑制作用，酶在20%Triton X-100和Tween80作用下的相对酶活分别为79.61%和65.05%。而DTT（1 mM和5 mM）对酶活有一定的促进作用。低浓度H2O2对酶活有一定的促进作用，酶在1%和5%H2O2作用下的相对酶活分别为177.55%和148.88%；高浓度H2O2抑制酶活，酶在10%H2O2作用下的相对酶活是95.44%，略有下降；而H2O2高达20%时，相对酶活迅速降低，相对酶活仅为12.15%。盐度对酶活的影响表现为，随着盐浓度（NaCl和Na2SO4）升高，酶活先升高后降低。NaCl和Na2SO4浓度分别为0.25 M和0.1 M时，酶活最高，当NaCl浓度达到3 M时，酶活仍在30%以上；而Na2SO4浓度在1 M时，酶活就已降至33.49%。
　　将从菌株Bacillusamyloliquefaciens sp. F1分离纯化的丝氨酸蛋白酶PF1进行质谱分析，经序列比对发现为纤维蛋白溶解酶，根据已报道的序列设计引物，以Bacillusamyloliquefaciens sp. F1的基因组为模板，利用PCR技术克隆基因。编码该蛋白酶的基因序列全长1146 bp，编码381个氨基酸残基。利用CDD数据库分析PF1前体结构，结果表明包括3个结构域：信号肽（Signal Peptide,1～24 AA）、前导肽（pre-sequence,25～106 AA）、催化结构域（peptidase-S8,107～381 AA）。利用Expasy对序列进行分析预测，该蛋白酶的等电点为9.3，分子量为39.8 kDa。

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