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【6h】

微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-苯丙氨酸的研究

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第一章文献综述

引言

1.1 L-Phe概况

1.1.1 L-Phe的理化性质

1.1.2 L-Phe的应用及国内外市场概况

1.1.3 L-Phe的生产方法

1.2细胞固定化技术

1.2.1吸附法:

1.2.2离子/共价交联:

1.2.3包埋法:

1.2.4生物微胶囊技术

1.2.5 SA-CMC/CaCl2微胶囊体系

1.2.6 NaCS-PDMDAAC微胶囊体系

1.3 L-Phe的萃取分离

1.4本课题的研究意义及研究内容

1.4.1研究意义

1.4.2研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1菌种及其保藏

2.1.2培养基

2.1.3其它主要试剂及仪器

2.2实验方法

2.2.1培养方法

2.2.2菌体生长量测定

2.2.3葡萄糖浓度的测定

2.2.4 L-Phe测定

2.2.NaCS的制备

2.2.6微胶囊的制备

2.2.7微胶囊的机械性能

第三章有机溶剂萃取分离L-Phe

引言

3.1材料和方法

3.1.1实验试剂

3.1.2实验方法

3.1.3分析方法

3.2实验结果与讨论

3.2.1稀释剂对实验的影响

3.2.2萃取前后水相溶液pH值的变化

3.2.3 L-Phe浓度对D的影响

3.2.4 D2EHPA浓度对D的影响及萃合物的结构

3.2.5不同温度对D的影响

3.2.6负载L-Phe有机相的反萃取

3.3小结

第四章游离重组大肠杆菌细胞生长特性

引言

4.1游离细胞生长特性

4.2萃取剂的生物相容性

4.3 SA-CMC/CaCl2微胶囊的生物相容性

4.3.1 SA的生物相容性

4.3.2 CMC的生物相容性

4.3.3 CaCl2的生物相容性

4.3.4 SA-CMC/CaCl2微胶囊的生物相容性

4.4 NaCS-PDMDAAC微胶囊的生物相容性

4.4.1 NaCS的生物相容性

4.4.2 PDMDAAC的生物相容性

4.4.3 NaCS-PDMDAAC微胶囊生物相容性

4.5本章小结

第五章SA—CMC/CaCl2微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe

引言

5.1 SA-CMC/CaCl2微胶囊制备条件的确定

5.1.1 CMC制备浓度的确定

5.1.2 SA制备浓度的确定

5.1.3 CaCl2浓度的确定

5.1.4 SA-CMC/CaCl2微胶囊的机械性能

5.2 SA-CMC/CaCl2微胶囊萃取发酵生产L-Phe

5.2.1 SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化细胞生长特性

5.2.2 SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化细胞萃取发酵特性

5.3本章小结

第六章NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe

引言

6.1 NaCS-PDMDAAC微胶囊制备条件的确定

6.1.1 NaCS制备浓度的确定

6.1.2 PDMDAAC制备浓度的确定

6.1.3 NaCS-PDMDAAC微胶囊的机械性能

6.2 NaCS-PDMDAAC微胶囊萃取发酵生产L-Phe

6.2.1 NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化细胞生长特性

6.2.2 NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化细胞萃取发酵特性

6.3本章小结

第七章结论与建议

7.1结论

7.2建议

参考文献

附录

在读期间发表论文

致谢

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摘要

作为人体八种必需氨基酸之一的L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine,L-Phe),是一种重要的合成中间体,在食品和医药领域有广泛的应用,可作为食品添加剂、抗癌药物中间体和合成阿斯巴甜的原料,具有非常广阔的市场前景。 利用固定化重组大肠杆菌细胞发酵生产L-Phe,是当前制备L-Phe应用最广泛的一种方法。本文利用两种新型微胶囊——SA-CMC/CaCl2微胶囊体系与NaCS-PDMDAAC微胶囊体系对重组大肠杆菌进行固定化,探索了它们在萃取发酵生产L-Phe过程中的特性,并与游离细胞培养作了比较,试图对实验室探索L-Phe的工艺以及大规模生产L-Phe提供理论依据。 论文先对有机溶液萃取分离L-Phe作了比较系统的研究:以磷酸二(2-乙基己基)脂(D2EHPA)为萃取剂,环己烷为稀释剂萃取L-Phe,研究了L-Phe浓度、D2EHPA浓度、温度对萃取分配系数D的影响,以及负载L-Phe有机相的反萃取特性。结果表明:萃取分配系数D随温度的升高而降低,而L-Phe浓度对分配系数的影响还与水相初始pH值有关;萃合物是以一个L-Phe分子和二个D2EHPA分子结合而成。在利用酸溶液对负载L-Phe有机相的反萃取过程中,反萃取的效果符合HCI>HNO3≥H2SO4>CH3COOH,且随HCl浓度和温度的升高而升高。 然后研究了游离重组大肠杆菌细胞生长特性,结果表明:在游离培养的情况下,培养12 h时即可达稳定期,葡萄糖也在这一时间段内被迅速消耗,到14 h时葡萄糖已消耗完全,而L-Phe的产量在对数期(10 h左右)达到峰值,但此后出现一定的下降,这可能是在游离培养达稳定期时被细胞消耗所致。萃取剂对重组大肠杆菌具有毒害作用,所以在后续的研究过程中,必须避免使菌体细胞直接与萃取剂进行接触。而两种新型固定化体系——SA-CMC/CaCl2微胶囊体系和NaCS-PDMDAAC微胶囊体系具有良好的生物相容性,可用于重组大肠杆菌的发酵生产过程。 接下来研究了SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,先是确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:12~14 g L-1的CMC,8~10 g L-1的SA,12~14 g L-1的CMC,80~100 g L-1的CaCl2。然后考察了不同制备浓度制备的微胶囊的机械性能,结果表明SA-CMC/CaCl2微胶囊在萃取剂存在的情况下稳定性非常差,其中以12.0 g L-1 CMC、10.0 g L-1SA、100.0 g L-1CaCl2制备得到微胶囊的稳定性相对较好。最后考察以12.0 g L-1CMC、10.0 g L-1SA、100.0g L-1CaCl2制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe的情况,结果表明:由于受传质的影响,SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化培养的延迟期延长了2 h左右,但最终的菌体浓度略为升高;另外在生长末期,微胶囊固定化情况下的L-Phe没有明显的消耗;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵过程的产量约为1.70 g L-1L-Phc;14 h的产量约为10.40 g L-1L-Phc。 最后考察了NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产I-Phe,先确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:3%~4%的NaCS,4%~5%的PDMDAA.然后考察了不同制备浓度下制备的微胶囊的机械性能,结果表明NaCS-PDMDAAC微胶囊具备非常良好稳定性,并不受萃取剂的影响。综合考虑传质因素,认为以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到微胶囊用于固定化重组大肠杆菌培养更好。研究以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phc,结果表明:由于NaCS-PDMDAAC微胶囊囊膜非常致密,受传质影响,NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化培养的延迟期比游离培养延长了4 h左右,比SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化培养延长了2 h左右,而且最终的菌体浓度相对偏低、葡萄糖并未完全消耗,最终的残糖浓度约为4 g L-1左右;另外,在生长末期,L-Phe不存在消耗过程;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵产量约为12.50 gg L-1L-Phe;22 h的产量约为13.16 g L-1 L-Phc。

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