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人脐血间充质干细胞培养条件及治疗大鼠脑损伤的初步研究

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前言

第一部分人脐血间充质干细胞培养条件比较

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分人脐血间充质干细胞对大鼠脑损伤的治疗效果分析

摘要

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

致谢

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摘要

目的： 摸索人脐血间充质干细胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells,UCB-MSCs)的培养条件，探讨来源于人脐血的间充质干细胞局部定位注射治疗大鼠缺血缺氧脑损伤的可行性及治疗效果。 方法： 1.取新生儿新鲜脐带血48例，其中来源于早产儿的20例，足月儿的28例，分为早产组和足月组； 2.每例样本分为2份，分别采用普通培养基和特殊培养基进行培养； 3.48例样本里，有8例样本采血量5ml，20例样本采血量10ml，20例样本采血量20ml，每例分为两份，分别用普通培养基和特殊培养基培养。比较采血量、胎龄、培养基几个因素对UCB-MSCs生长的影响。 4.统计分析：将所得数据输入SPSS11.5软件进行分析，样本采血量和不同胎龄所得数据采用分层资料的X2检验，培养基因素所得数据采用两配对样本X2检验，比较几个不同因素对细胞的生长有无影响，P<0.05为有统计学意义。 5.采用200g左右的雄性SD大鼠54只，制作大鼠局部脑缺血缺氧模型。过程：结扎右侧颈总动脉(commoncarotidartery，CCA)、颈外动脉(externalcarotidartery，ECA)，微动脉夹夹闭颈内动脉(internalcarotidartery,ICA)，经CCA、ICA插入直径0.24mm的鱼线，至距离剪口处约2.0cm，至大脑中动脉(middlecerebralartery,MCA)分支处，即阻断ACA血流，缺血2h后拔出鱼线实现再灌流。将建模成功后的大鼠模型分为试验组和对照组，于模型建立后第1天按照ZeaLonga等的神经缺损评分标准对2组模型进行评分。评分标准：0分：无神经缺损症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧；4分：不能自发行走，意识丧失。 6.建模成功后第7天，将培养成熟的经DAPI标记的UCB-MSCs经颅内定位注射的方法移植入模型鼠脑内，注射部位在缺血对侧侧脑室处(前囟旁开1.5mm，后1mm)，注射量为1×106/μl的UCB-MSCs悬液5μl，对照组注射等量的生理盐水。 7.对比移植前实验组和对照组神经缺损评分，移植治疗后28天试验组和对照组神经缺损评分。 8.观察比较两组动物行为改变，(1)水迷宫实验：选择直径为1m的圆桶，桶内水深为62cm，将圆桶平均分成4个象限。桶内设有一直径为6cm高为60cm的圆柱状有机玻璃站台，水中混入面粉制成不透明的混悬液。首先将站台设在第一象限，开始训练。将大鼠每天分别从第一至第四象限入水训练4次，记录每次大鼠登上站台的时间，若大鼠60s仍未登上站台将其捉上站台停留10s。每次训练间隔时间为30～60s，连续训练6d。第7d将站台转移至其它象限，记录大鼠分别从第1至第4象限入水后登上站台的时间和其在第1象限的逗留时间及运动轨迹。(2)旷场实验：装置为36cm×36cm×36cm无顶方盒，箱底用墨线等分成9个小方格，将大鼠置于中央小方格内，观察30s内活动情况。计分标准：大鼠1/2以上身体从所在方格进入相临方格计1分，大鼠后肢站立计1分，两者相加为其总分。 9.统计分析：所有数据以均数±标准差(x±S)表示，输入SPSS11.5软件进行分析，迷宫实验和旷场实验结果采用两样本t检验，比较细胞移植治疗对动物行为的改善，P<0.05为有统计意义；神经缺损1天和神经缺损28天所得数据采用两独立样本非参数检验，分别比较实验组和对照组中神经缺损1天和28天的分值，P<0.05为有统计学意义。 10.免疫组化：行为学实验后处死大鼠，一部分样本直接进行DAPI荧光阳性检测，另选取部分样本固定切片后用毛细滴管吸取经稀释后的兔抗MAP2-抗滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30分钟。然后用0.01mol/lpH7.2PBS洗两次，10min，用吸水纸吸去或吹干余留的液体，再滴加FITC标记的羊抗兔IgG抗体，同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，激光共聚焦显微镜下观察照相。 结果： 1.不同采血量的比较：48例样本里，有8例样本采血量5ml，20例样本采血量10ml，20例样本采血量20ml，每例分为两份，分别用普通培养基和特殊培养基培养，这样共96份脐血样本，其中16份脐血量2.5ml，40份样本脐血量5ml，40份样本脐血量10ml。其中16份2.5ml的脐血样本培养3天后均未出现目标细胞，5ml和10ml的样本组80份培养3天后均出现不同程度的贴壁现象，20例5ml样本组，最终普通培养基组只有2例成功培养出传代细胞，特殊培养基组有5例，20例10ml样本组，普通培养基组最终有5例培养成功，特殊培养基组中有7例成功。贴壁细胞主要有两种形态，小圆形细胞和短梭形细胞。分层资料X2结果示P值均大于0.05(普通培养及和特殊培养基的P值分别为0.407、0.731)，说明不管普通培养基组还是特殊培养基组，5ml样本量和10ml样本量对细胞培养成功率无影响。而2.5ml组的样本量细胞过少，难以维持细胞生长所需的体系。 2.不同胎龄的比较：采脐血样本共48例，其中来自早产儿的有20例，足月儿的有28例，每例分为2份，分别用普通培养基和特殊培养基进行培养，最终有29例样本在两种培养基下均无贴壁细胞出现，其中早产样本10例，足月样本19例，剩余样本均于原代培养2天左右出现贴壁细胞，普通培养基组有7例培养成功，其中早产脐血6例，特殊培养基组有17例培养成功，其中早产脐血有12例。得到的间充质干细胞，呈典型的梭形，形态与骨髓间充质细胞相似，体积略瘦小。随培养时间延长，细胞体积逐渐增大伸展。其余得到的为异质性贴壁细胞，细胞不均一，形态多样。有的呈小圆形、不规则形，有的呈短梭形、大圆形细胞；有的呈荷包蛋样；有的呈星形；有的体积巨大多个核。分层资料X2结果示普通培养基组和特殊培养基组P值均小于0.05(P值分别为0.016、0.001)，说明胎龄是影响细胞生长、培养成功的一个因素。 3.不同培养基的比较：48例样本中，普通培养基和特殊培养基均培养成功的有5例，特殊培养基培养成功的有17例，普通培养基培养成功的有7例，最终得到均一的间充质干细胞，传1～2代以后才可以纯化。配对样本x2检验结果得P>0.05(P=0.08)，说明两种培养基对细胞的影响无显著性差异。 4.脐血间充质干细胞表面标志的测定脐血间充质样干细胞不表达造血标志CD34、CD45，不表达内皮细胞的CD106标志，强烈表达与CD105、CD29等表面标识，和检测的骨髓结果相似，这表明MSC是区别于脐血中造血细胞的另一类细胞。 5.行为学检查：制作CMAO模型54只，成功38只，将受试大鼠分为实验组和对照组，其中实验组例数20只，对照组例数18只，实验组中细胞移植后有2只大鼠死亡，最终有18只动物接受了所有的行为学实验，对照组中有1只死亡，17只大鼠接受了所有的行为学实验。 (1)水迷宫的实验结果：实验组登上站台的平均时间为22.33s，对照组为30.18s，P<0.01(P=0.000)，差异显著。对照组有2只大鼠从训练日开始至实验结束始终绕着圆桶周边运动，没有一次登上站台。 (2)旷场实验结果：实验组平均得分1.06分，对照组平均得分1.35分，两者比较无显著性差异(P=0.354)。 6.神经缺损评分：局灶性脑缺血后1d，实验组和对照组大鼠评分分别为：3.00和3.18，两者比较无显著性意义(P=0.256)，移植后28d实验组和对照组大鼠神经缺损评分分别为0.75、1.47，P<0.05(P=0.002)，差异显著。 7.组织学检查：大脑中动脉阻塞后，最严重的缺血部位是尾状核的外侧和同侧的皮质，严重的病例甚至相邻的皮质完全消失。移植组和对照组的脑损伤的范围和部位在外观上没有明显区别。移植了神经干细胞的大鼠在移植部位发现了DAPI染色阳性的细胞，细胞分布弥散，没有明显聚集的特征，局部亦无肿瘤形成。对照组中的脑内没有发现DAPI阳性的细胞。DAPI和MAP2双荧光染色可在移植细胞鼠脑切片内看到蓝色的核及蓝绿色的胞浆。 结论： 脐血干细胞培养过程中，脐血的样本量、胎龄、培养基的质量对其的成活、生长有关键作用。5ml样品组和10ml样品组不管是用普通培养基培养还是用特殊培养基，两组细胞的培养成功率在统计学上无显著性差异，说明5ml-10ml的样本量均有利于脐血间充质干细胞的培养，可能是这两组的细胞密度适宜于维持细胞生长的体系。2.5ml的样本量则不具备此条件。统计学上提示早产病例较足月病例脐血培养出MSCs细胞的概率要大，说明胎龄是影响脐血间充质细胞的一个因素。普通培养基和特殊培养基对脐血间充质细胞的影响在统计学上无显著差异，但实验过程中发现，在细胞不断的分裂生长过程中，特殊培养基中的细胞增殖比较旺盛，培养出的细胞也更为单一。用人脐血间充质干细胞治疗大鼠脑损伤，移植后28天实验组脑组织仍可见DAPI荧光染色阳性细胞，说明移植细胞能在HIBD大鼠脑内存活，实验组中DAPI和FITC双荧光均阳性，提示体外培养的UCB-MSCs在体内可能通过诱导成神经细胞发挥作用。实验组动物较对照组动物的学习能力有所改善，用人脐血间充质干细胞治疗脑损伤还是有一定疗效的。

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