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骨形态发生蛋白Bmp2a调控斑马鱼生物钟研究

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第一章 文献综述

1.1 BMP信号通路

1.2 斑马鱼作为模式生物的优点

1.3 斑马鱼bmp2a基因

1.4 斑马鱼生物钟

1.5 bmp2a基因与松果体

1.6 CRISPR-Cas9技术及在斑马鱼上的应用

1.7 立题意义和主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验仪器

2.3实验试剂

2.4常用试剂配制

2.5引物设计

2.6实验方法及设计

第三章 实验结果及分析

3.1斑马鱼bmp2a基因受生物钟调控

3.2斑马鱼bmp2a基因受光照调控

3.3利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼bmp2a基因的突变体

3.4斑马鱼bmp2a+/-高通量深度测序结果分析

3.5 斑马鱼bmp2a突变体中的行为节律发生改变

3.6 斑马鱼bmp2a突变体中的核心生物钟基因表达发生改变

3.7斑马鱼Bmp2a增强per2基因的表达

3.8 拯救实验

3.9 斑马鱼Bmp2a与其他per基因

第四章 讨论和展望

4.1 斑马鱼bmp2a突变体构建分析

4.2 bmp2a缺失对斑马鱼生物钟影响

4.3 斑马鱼Bmp2a增强per2基因的表达

4.4 斑马鱼bmp2a+/-高通量深度测序结果分析

4.5 生物钟与骨骼发育

第五章 结论

参考文献

研究生期间已发表和待发表的论文

附录

致谢

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摘要

骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic proteins,BMPs)除了诱导硬骨和软骨的发生,同时还参与调控牙齿、肾脏、皮肤、毛发、肌肉、造血和神经元的发育,以及维持体内的铁代谢和血管内稳态。Bmp2a作为BMP家族中的一员,通过结合BMPI型受体与II型受体进行信号转导从而激活目的基因。有文献报道在斑马鱼胚胎发育的早期阶段,bmp2a基因在松果体中表达,因而Bmp2a可能参与到斑马鱼的生物钟调控。但是关于生物钟与bmp2a基因的关系目前还没有研究。
  本文首先通过细胞转染实验发现 Clock1a-Bmal1b异二聚体可以激活bmp2a-luc的表达,并且通过ChIP实验发现Bmal1b可以直接结合到位于bmp2a基因启动子区域的E like-box上,证明bmp2a基因受生物钟调控。此外我们还发现,光照对于bmp2a基因的表达具有调控作用,细胞转染实验发现Tefa可以激活bmp2a-luc的表达,ChIP实验发现Tefa可以直接结合到位于bmp2a基因启动子区域的D-box上,证明bmp2a基因直接受Tefa调控。我们利用CRISPR-Cas9技术成功构建bmp2a突变体,并得到了稳定遗传的突变品系。高通量深度测序的结果显示bmp2a突变体中很多核心生物钟基因发生改变,并且per2基因的下调极为明显。定量PCR证明高通量测序结果的正确性。我们发现,在行为学分析中,在恒暗或恒光的条件下,bmp2a突变体幼鱼的行为周期与野生型幼鱼相比延长了0.4小时,这与之前本实验室发现的 per2突变体幼鱼的行为周期变化保持一致。细胞转染实验表明Bmp2a可以激活per2-luc的表达,且激活效应随着Bmp2a浓度的升高随之增强。ChIP实验发现Bmp2a可以直接结合到位于per2基因启动子区域的Smad结合位点(SBE)上,而Smad是BMP信号通路的重要核内分子,证明per2基因直接受Bmp2a调控。综上,我们发现bmp2a基因受生物钟与光照调控,并且通过促进per2基因的表达从而调控斑马鱼的生物钟。

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