人B7-H4-Fc融合蛋白的制备及B7-H4受体表达的检测

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B7-H4分子是近年新发现的一个B7家族成员，其与受体结合后通过抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子的活性，进而抑制T细胞的增殖、活化和细胞因子的产生，发挥其负性调节的作用。人B7-H4分子定位于人染色体1p11.1，由6个外显子和5个内含子组成，其mRNA在淋巴和非淋巴组织中呈广泛性表达，但由于受到转录后水平的严格调控，B7-H4蛋白仅在正常组织中呈现微弱的表达。近来的研究表明，B7-H4分子在正常人新鲜分离的 T、B淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs）表面均无表达，但可以被体外活化刺激因子诱导表达，研究还发现，B7-H4分子在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤相关巨噬细胞中异常高表达。这些证据都表明在肿瘤微环境中 B7-H4的表达对肿瘤细胞逃避机体的免疫监视具有重要作用。目前，B7-H4分子的受体还未发现，但关于其受体的研究是目前免疫学研究的热点之一，其受体的发现将会对帮助我们更进一步的了解B7-H4分子的作用机制，为临床应用提供一定的理论依据。
　　本研究旨在通过构建 B7-H4-Fc融合蛋白的真核表达体系，获得高纯度的B7-H4-Fc融合蛋白，利用免疫沉淀法分离B7-H4受体，并利用荧光标记的B7-H4-Fc融合蛋白检测B7-H4受体在不同临床标本中的表达。
　　一、人B7-H4-Fc融合蛋白的表达及其应用研究
　　【目的】体外克隆扩增人B7-H4分子的胞外段基因以及人Fc段基因，将其重组至pEGZ–Term真核表达载体，构建表达人B7-H4-Fc融合蛋白的基因转染细胞株并初步研究B7-H4-Fc融合蛋白的生物学功能。
　　【方法】通过PCR的方法体外扩增人B7-H4分子的胞外段基因和人Fc段基因，并分别克隆入T载体中，双酶切后装入逆转录病毒载体pEGZ–Term中，构建重组真核表达载体pEGZ–Term/B7-H4-Fc并进行鉴定；与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T制备含有重组病毒的培养上清，以其培养上清感染CHO细胞，经Zeocin筛选出稳定表达B7-H4-Fc融合蛋白的CHO细胞株；通过流式细胞术和Western Blot检测CHO/B7-H4-Fc转基因细胞株是否构建成功，纯化鉴定B7-H4-Fc融合蛋白并对其生物学功能进行初步研究。
　　【结果】成功构建了pEGZ–Term/B7-H4-Fc重组真核表达载体，筛选并鉴定获得能稳定高表达人B7-H4-Fc融合蛋白的转基因细胞并分离纯化出了该融合蛋白，初步检测该融合蛋白具有体外抑制T细胞增殖的作用，并利用该融合蛋白成功的分离纯化出了B7-H4受体。
　　【结论】成功的构建了能稳定表达B7-H4-Fc融合蛋白的转基因细胞株，并分离纯化出B7-H4-Fc融合蛋白，为进一步研究B7-H4分子的生物学功能奠定基础。利用免疫沉淀的方法，分离出了B7-H4受体分子。
　　二、检测B7-H4未知受体的表达
　　【目的】利用荧光标记的B7-H4-Fc融合蛋白，检测B7-H4受体在多种细胞表面的表达。
　　【方法】以本研究获得的B7-H4-Fc融合蛋白为基础，对其进行异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记，利用FITC标记的B7-H4-Fc蛋白作为配体，流式细胞术检测多种不同来源的淋巴细胞上B7-H4受体的表达。
　　【结果】检测分析发现在来源于扁桃体的部分B淋巴细胞上组成性的表达B7-H4受体，在活化T细胞和肺癌组织、肺癌转移淋巴结来源的T细胞也表达B7-H4受体。
　　【结论】检测到组成性表达B7-H4受体的B淋巴细胞使我们提取B7-H4受体蛋白进行进一步的研究成为可能。B7-H4受体在肺癌肿瘤组织及其转移淋巴结中T细胞上的表达，提示T淋巴细胞可能在肿瘤微环境中接受其再教育后，通过表达B7-H4受体，与肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞等细胞表面的B7-H4分子以及肿瘤微环境中可溶性的B7-H4分子相互作用，导致T细胞的免疫忽视，帮助肿瘤细胞逃避免疫监视和抗肿瘤免疫应答。

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作者
邵联波;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名顾宗江;
年度 2013
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫疗法;
关键词
B7-H4-Fc融合蛋白; B7-H4受体; 检测方法; 免疫机制; 肿瘤微环境;

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