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新型乳酸菌表面展示系统的构建及其潜在应用研究

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乳酸菌是一类重要工业微生物，在食品发酵、生物制药、畜牧养殖等方面广泛应用，是公认的安全级(Generally recognized as safe，GRAS)微生物。随着乳酸菌分子生物学研究的深入，建立了较为完善的乳酸菌基因工程操作规程和分子工具，包括转化流程、载体系统、整合及扩增系统等，为开辟乳酸菌新的应用领域提供了可能，其中以乳酸菌为载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面，继而诱导黏膜免疫和系统免疫成为乳酸菌新功能开发的一个重要方向。外源蛋白在乳酸菌中的表达方式有三种：一是目的蛋白在细胞质中表达；二是在信号肽作用下将目的蛋白分泌到培养基中；三是目的蛋白锚定在细胞壁上。将外源蛋白展示在乳酸菌表面是一种有效的研究工具并在活载体疫苗开发、诊断学、全细胞吸附剂以及新的生物催化剂等方面具有潜在应用价值。因此本文主要工作是利用两种不同类型的细胞壁锚定结构域(乳杆菌表层蛋白、乳杆菌噬菌体裂解酶的LysM重复序列)通过不同方式构建乳酸菌表面展示系统，并利用这些展示系统成功在乳酸菌细胞表面展示不同功能蛋白，具体内容和成果如下：
　　 1.具有表面蛋白菌株的筛选以及表面蛋白的鉴定与克隆
　　 乳酸菌是人和动物肠道的正常菌群，具有维持肠道平衡、抑制病原菌及提高机体免疫力等作用。研究发现包括表层蛋白(S-层蛋白)在内的一些乳酸杆菌表面蛋白参与肠道上皮细胞的黏附和定植，这是乳杆菌发挥其益生作用的关键。到目前为止，在许多乳杆菌表面发现S-层蛋白，它在胞内合成，通过信号肽穿过细胞膜并通过与细胞壁上的磷壁酸或者肽聚糖作用锚定在细胞表面，因此，乳杆菌S-层蛋白的细胞壁结合结构域有作为锚定基序构建表面展示系统的潜在应用价值。本文从鸡肠道中分离得到45株乳杆菌，通过与人结肠腺癌细胞系HT-29细胞的体外黏附实验筛选到2株高黏附菌株K2-4-3及K3-1-3，SDS-PAGE分析以及透射电镜观察，发现在这2株乳酸菌细胞表面分别含有分子量为45 kDa和56 kDa的表层蛋白。根据已报道的S-层蛋白基因序列设计引物，扩增得到菌株K2-4-3表层蛋白的保守序列：再根据保守序列设计引物，利用Ligation-anchoredPCR扩增获得菌株K2-4-3表层蛋白基因(slpB)的全长序列，大小为1，323 bp，编码440个氨基酸，经BLAST比对发现与Lactobacillus crispatus的S层蛋白同源性达95％。
　　 2.利用S层蛋白细胞壁锚定域构建乳酸菌表面展示体系及靶向表达系统
　　 在芽孢杆菌中已成功利用S-层蛋白将目的蛋白展示在细胞表面，但乳杆菌中这部分的研究相对较少，因此本文探讨和分析S-层蛋白作为乳酸菌锚定基序的潜在应用价值。序列分析发现Lb.crispatus K2-4-3表层蛋白(SlpB)的C端序列(LcsB)和Lb.acidophilus及Lb.crispatus表层蛋白的细胞壁锚定结构域有高度同源性，暗示LcsB可作为乳酸菌表面展示外源蛋白的分子载体。为了验证LcsB作为锚定基序构建乳酸菌表面展示系统的可行性，本文将绿色荧光蛋白基因(gfp)和lcsB基因进行融合，构建大肠杆菌融合表达载体pET-gfp-lcsB，并导入到大肠杆菌中表达融合蛋白GFP-LcsB。将纯化后的融合蛋白与不同乳酸菌细胞孵育后，荧光显微镜观察在Lb.delbrueckii、Lb.brevis、Lb.helveticus、Lb.johnsonii、Lb.crispatus、Streptococcus thermophilus、Lactococus lactis和Lb.salivarius细胞表面均具有GFP绿色荧光，表明在LcsB引导下GFP蛋白被展示在乳酸菌细胞表面。为阐明LcsB在乳酸菌细胞壁上的作用位点，对乳酸菌细胞做不同预处理，分析不同处理对GFP-LcsB结合能力的影响，结果表明SDS处理可以提高GFP-LcsB的结合能力，而TCA处理降低GFP-LcsB在Lb.delbrueckii细胞表面的结合量，表明LcsB在细胞壁表面的结合位点是磷壁酸，每个细胞大约结合107个GFP-LcsB蛋白分子。为验证以LcsB作为锚定基序的乳酸菌细胞表面展示系统的应用价值，选取分子量较大的半乳糖苷酶以及哈氏噬纤维素菌的纤维素酶代替GFP，结果发现在LcsB锚钩作用下半乳糖苷酶和纤维素酶被展示在乳酸菌细胞表面，并检测到相应的酶活性。对展示酶的稳定性进行分析，结果发现固定化的纤维素酶可以反复利用9次，细胞表面仍具有酶活性，但异源蛋白的展示能力与菌株以及目的蛋白性质有关。将GFP-LcsB和Gal-LcsB两种融合蛋白以不同的比例和乳酸菌细胞孵育后，GFP和Gal能同时结合在乳酸菌细胞表面，这为开发多价疫苗奠定了基础。
　　 为了进一步验证LcsB锚定蛋白的功能，将gfp-lcsB融合基因替代载体pSec：Leiss：Nuc的结构基因leiss：nuc，得到重组质粒pSec：gfp：lcsB，将其转化L.lactis NZ9000中获得重组菌株，经nisin诱导后，荧光显微镜观察重组菌株出现绿色荧光，说明融合蛋白GFP-LcsB在L.lactis中成功表达。利用SDS-PAGE分析、Western blot、荧光扫描分析、免疫荧光技术以及SDS敏感性分析均证实了GFP在L.lactis NZ9000细胞表面成功表达。这是首次利用乳杆菌S-层蛋白的细胞壁锚定结构域在乳酸菌细胞内通过体外结合以及体内靶向表达两种方式展示外源蛋白的报道，为乳酸菌新功能开发提供了工具。
　　 3.以乳酸菌为载体的禽流感病毒口服疫苗的构建以及免疫原性分析
　　 以乳酸菌作为载体传送疫苗有着诱人前景，为研究乳杆菌S-层蛋白在乳酸菌活菌疫苗方面的巨大潜力，本文利用Lb.crispatus LcsB锚定基序的表面展示系统研究了两种亚型禽流感病毒H5N1及H9N2的血凝素蛋白(H5A和H9A)同时在乳杆菌表面展示的可行性和免疫原性。提取病毒基因组RNA，以反转录cDNA为模板扩增两种亚型的血凝素基因(h5a和h9a)。将H5A和H9A蛋白及其与LcsB连接的融合蛋白H5A-LcsB和H9A-LcsB分别在大肠杆菌中表达，表达后的融合蛋白与Lb.johnsonii进行结合反应，免疫荧光技术及SDS-PAGE分析均证明H5A和H9A在LcsB引导下结合到Lb.johnsonii细胞表面。用分别结合了H5A，H9A以及H5A&H9A的Lb.johnsonii菌体细胞免疫小鼠，ELISA证明口服疫苗均能成功刺激细胞产生黏膜免疫反应。
　　 4.利用乳杆菌温和噬菌体裂解酶的LysM重复序列构建细胞表面展示体系及其特性研究
　　 全基因组测序发现发酵乳杆菌温和噬菌体()PYB5含有一个裂解酶基因lyb5，生物活性鉴定裂解酶Lyb5含有一个宽的裂解谱，可以裂解大多数的革兰氏阳性细菌和阴性菌，说明Lyb5可以与不同菌的细胞壁结合。序列分析得知Lyb5蛋白包含三个功能域：29个氨基酸的信号肽，N端水解酶活性区域以及C端的细胞壁结合结构域。其中C端细胞壁结合结构域(Ly5C)含有三个LysM重复序列，表明其有可能作为分子载体展示异源蛋白。本文首先以绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因，构建含有gfp基因和ly5C的融合表达载体pET-gfp-ly5C，将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞内，并且在IPTG的诱导下表达GFP-Ly5C融合蛋白。融合蛋白经纯化后和乳酸菌细胞孵育，荧光显微镜观察发现L.lactis，Lb.casei，Lb.brevis，Lb.plantarum，Lb.fermentum，Lb.delbruekii，Lb.helveticus和S.thermophilus细胞表面发出绿色荧光，表明Ly5C可以将异源蛋白(GFP)结合在乳酸菌细胞表面。通过分析不同化学分子处理细胞对GFP-Ly5C融合蛋白结合的影响发现，Ly5C作用于细胞壁肽聚糖且TCA处理能够有效提高GFP-Ly5C的结合量，这和LcsB与细胞壁的作用机制不同，表明Ly5C和LcsB是两种不同类型的细胞壁锚定基序，这为根据目的蛋白和宿主菌的不同来选择合适的载体蛋白进行细胞表面展示提供了多种选择。分析菌体生长时期、pH、NaCl浓度以及结合时间等参数对GFP-Ly5C结合的影响并确定最佳结合条件，优化后GFP-Ly5C与TCA处理细胞以及未处理细胞的结合能力均有大幅度的提高，这为利用活细胞展示异源蛋白提供了可能。此外，我们也利用该系统将半乳糖苷酶展示在乳酸菌细胞表面。
　　 5.Nisin诱导型启动子库的建立
　　 启动子对于控制目的基因表达起关键作用。乳酸菌中应用最广泛、可控性最强的表达系统是NICE系统，该系统所用的启动子为nisin诱导型启动子。为了将NICE系统应用于控制外源代谢途径总体流量及各个酶反应效率，需要表达强度不同的启动子。因此构建诱导型合成启动子库可以实现不同基因在同一诱导物下以不同强度表达外源基因的目的。序列分析nisin启动子发现其含有两个-10区和-35区，利用gfp作为报告基因比较两个-10区和-35区在不同nisin诱导浓度以及诱导时间的表达效率，发现靠近起始密码子的-10区和-35区可以有效的启动基因的表达。为建立诱导型合成启动子库，对nisin启动子进行随机突变，利用报告基因gfp筛选不同表达强度的启动子，最后得到35个诱导型启动子和14个组成型启动子组成的合成启动子库，用该启动子库表达半乳糖苷酶发现该启动子库的表达效率是稳定的。Nisin合成启动子库的构建为下一步利用诱导型启动子库精细调节基因表达提供了工具。

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