化学修饰对适冷蛋白酶MCP-01结构和功能的影响以及MCP-01自溶机制的研究

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本论文以假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp．SM9913所产适冷蛋白酶MCP-01为研究对象，研究包括氨基酸序列分析、酶的自溶机制以及化学修饰对酶结构和功能的影响。通过对MCP-01氨基酸序列的比对，发现MCP-01与protease K subfamilv中的两条序列同源性最高(42％)，且含有该subfamily的保守序列，因此将MCP-01归于此subfamily。氨基酸组成的研究中，发现MCP-01的催化结构域和整个成熟酶都含有适冷酶的普遍特征：较高的酸性氨基酸、Gly含量，较低的碱性氨基酸、Pro、Arg含量、A-index值。分别以1DBI和1R64(PDB编号)为模版，对催化结构域和PKD结构域进行了三维模型构建：催化结构域的三维结构主要由α-螺旋和β-折叠组成，存在一个有α-螺旋和β-折叠围成的催化腔，参与催化的Ser、Asp、His存在于催化腔的底部；PKD结构域则主要由β-折叠，几乎不含α-螺旋和其他二级结构。在MCP-01自溶机制的研究中，我们探索了高T值SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE体系对MCP-01自溶片断的分辨能力。同时通过sigmascan对0.2mg/ml的MCP-01在35℃、50mM pH 7.5的tris-HCI缓冲体系中自溶速度的分析，判断MCP-01酶分子的降解是一级反应，说明酶分子与自溶片断之间没有相互降解作用。然后通过对自溶条带N端序列的测定，得到M1-M4的N端和MCP-01的完全同，说明该酶的自溶是从C端开始的；通过分析M5-M8的N端序列，得到4个自溶位点，全部位于催化结构域：Thr38位于S8结构域的N端，Ala63、A1a91、Ala203位于无规则蜷曲区域中。采用还原胺化、高碘酸盐氧化、戊二醛交联、EDC交联的方法，主要选取部分单糖和二糖为修饰试剂，对产物酶的热稳定性进行测定，发现0.1％戊二醛处理产物的稳定性略高于对照。于是选取戊二醛．葡糖胺的方法对MCP-01进行修饰，对修饰酶和对照的最适酶活温度、酶促反应动力学、热失活动力学、紫外吸收光谱、内源荧光光谱、Far-UV CD光谱、热变性动力学进行了分析。修饰酶的热失活半衰期t<,1/2>、热变性熔化温度T<,m>、变构自由能AG<'[＃]>都高于对照，反映出戊二醛-葡糖胺修饰酶的热稳定性有一定幅度的提高。根据热变性的AH<,m>(修饰酶>对照)以及CD光谱的θ<,222nm(修饰酶<对照)，推断热稳定性的提高丰要来自修饰酶α-螺旋含量的提高。另一方面，从酶促反应活化熵ΔS(修饰酶<对照)、热变性vant hoff熵ASm(修饰酶>对照)、紫外吸收光谱(修饰酶的增色和红移效应)、内源荧光光谱(修饰酶的减色和红移效应)来看，修饰酶的松散度(flexibility)也得到了提高，且松散度提高是修饰酶转换数(1<,cat>)得到提高的主要原因。但是，酶促反应动力学表明修饰酶的催化效率低于对照，主要原因是修饰酶的底物亲和力l／Km下降。

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作者
路敬涛;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科微生物学
授予学位硕士
导师姓名陈秀兰;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类微生物生物化学;
关键词
氨基酸序列分析; 三维模型构建; 化学修饰; 酶促反应动力学; 热失活动力学; 热变性动力学; 蛋白酶自溶; N端测序;

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