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HBV DNA载量、Toll样受体3的表达变化与慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型、功能的相关性研究

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前言

第一部分不同HBV DNA载量的慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞的表型、功能变化

第二部分慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞上Toll样受体的表达变化研究

参考文献

综述

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摘要

慢性乙型病毒性肝炎(ChmnicHepatitisB，CHB)的发病机制一直是传染病领域研究的重点、难点。至今，乙型肝炎病毒(HepatitisBⅥms，HBV)感染慢性化以及其持续感染的机制尚未阐明。在当前慢性乙型肝炎治疗缺乏有效措施的情形下，研究弄清HBV感染慢性化及持续感染的发生机制尤显重要、紧迫。 很多研究认为，HBV持续感染与体内树突状细胞(Dendriticcells，DCs)的功能下调密切相关，但对DCs功能下调的发生机制尚无一致认识。由于在CHB患者外周血中分离的DCs是在HBV感染后已经呈现持续感染状态中的细胞，我们认为此时机体的免疫状态应以适应性免疫(adaptiveimmune)为主，而HBV感染慢性化应是天然免疫(innateimmune)和适应性免疫共同作用的结果，因此，此时DCs的功能下调，可以解释HBV持续感染时机体的免疫状态，但这尚不能解释HBV感染慢性化的过程。 本课题中，我们以DCs的成熟障碍(Dysmatumtion)的发生机制为研究目的，联系天然免疫和适应性免疫中与DCs的生物学功能密切相关的关键因素：患者外周血HBVDNA载量和DCs上表达的Toll样受体(To1l-likereceptors，TLRs)，结合CHB的临床特征，开展研究。 第一部分 不同HBVDNA载量的慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞的表型、功能变化 目的 研究观察不同HBVDNA载量的慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DendriticCells，DCs)表型、功能变化，探讨HBV在DCs成熟障碍中的作用机制。 方法 筛选慢性乙型肝炎患者28例，入选时予PCR法测定外周血HBVDNA载量，经肝穿刺明确肝组织病理状念。入选病例符合HBVDNA载量>105copies／ml：除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病两个条件。入选后，所有病例予以核苷类似物抗病毒治疗24周，再次测定外周血HBVDNA及肝穿刺。依据治疗前后外周血HBVDNA载量分为两组：高载量组(CHB—H组)28例(HBVDNA>105copies/mD和低载量组(CHB．L组)25例(HBVDNA<104copies/mD。从患者外周血分离单核细胞，体外诱导培养DCs。用流式细胞仪测定DCs表型；MTT法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激增殖作用；EuSA法测定DCs分泌ILl2、ILl0等方法进行研究。同时以10例健康人作对照。 结果 1.CHB．H组慢性乙型肝炎患者肝组织炎症程度较CHB．L组为重，两者有显著性差异(P<0．05)，但两组间肝纤维化程度无显著性差异，P>0．05。 2.DCs在体外经细胞因子的刺激可明显增殖，但慢性乙型肝炎患者DCs的扩增数量、速度低于正常人(P<0．02)。 3.DCs表面标记：正常人的HLA．DR、CD86(B7-1)、CD80(B7—2)和CD83表达阳性率均大于80％，而两组cHB患者HLA-DR、CD86(B7-1)、CD80(B7-2)和CD83的表达率普遍降低，CHB．H组分别为43．22±8.22％、37．89±7．75％、39．24±856％及2031±4．86％；CHB．L组分别为45．11±7．99％、4037±652％、3748±7．71％和22．87±5．68％。CHB患者DCs表面分子HLA-DR、CD86(B7-1)、cD80(B7．2)和CD83的表达较正常对照均显著降低(P<0．001)，尤以CD83的降低更为显著；不同HBVDNA载量的两组CHB患者间则无显著性差异(p>0．05)。 4.两组慢性乙型肝炎患者的DC在MLR中的刺激能力无显著性差异(p>0．05)，但明显低于正常对照组(p<0．01)。 5.CHB．H组DCs、CHB—L组DCs和正常人DCs上清液中IL一10的量分别为(19．74±8．34)pg/ml、(2136±4．88)pg/ml和(25．23±946)pg/ml，各组间差异无显著性；在纯DCs培养和MLR中，IL一12的量CHB-H组为(10237±48．96)pg/ml，CHB．L组为(122．27±51．36)pg/ml则分别明显低于正常人DCs(304．55±10152)pg/ml和(u6．27±55．54)pg/ml，有显著性差异(P<0．005)。 结论 1.慢性乙型肝炎患者外周血HBVDNA载量与肝组织炎症程度成正相关； 2.慢性乙型肝炎患者外周血DCs存在成熟障碍； 3.慢性乙型肝炎患者外周血DCs表型缺陷、刺激T细胞功能F调； 4.慢性乙型肝炎患者DCs的表型变化、功能下调与外周血HBVD№载量间无显著相关性。 第二部分 慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞上T01l样受体3的表达变化研究 目的： 观测分析慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞上Toll样受体3(Toll-likereceptor3，TLR3)的表达变化，研究慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟障碍的原因，探讨HBV感染慢性化与持续感染的机制。 方法： 筛选慢性乙型肝炎患者20例。入选时予PCR法测定外周血HBVDNA载量。入选病例符合HBvDNA载量>105copies/ml；除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病两个条件。入选后，予以核苷类似物抗病毒治疗16周，再次测定外周血HBVDNA。依据治疗前后外周血HBVDNA载量分为两组：CHB—H组20例(HBVDNA>105copies／mD和CHB．L组17例(HBVDNA<104copies／mD。从患者外周血分离获取单核细胞，体外诱导培养DCs，对未成熟期DCs(immatumtiveDCs，imDCs)与成熟期DC(matumtiveDCs，mDCs)用流式细胞仪进行表型测定；EuSA法测定DCs分泌ILl2等方法进行研究；分别对imDCs与mDCs应用流式细胞仪法和免疫印迹法(westemb10t)法测定TLR3的表达。同时以10例健康人作对照。 结果： 1.DCs在体外经细胞因子的刺激可明显增殖，但较含胎牛血清的完全培养基的培养方式，其增殖速度较慢、数量较少(P＞0．05)； 2.正常人组DCs于培养第5、7天CD80、CD86、HLA—DR、CD83的表达率分另0为：2831±8．79、8235±8．67；3L17±11．23、79．61±10．08；27．61±10．28、92．79±8．48：23．46±n．53、83．76±5．47，各组间比较均有显著性差异，(PO．05。CHB．L组DCs于培养第5、7天CD80、CD86、HLA．DR、CD83的表达率分另0为：20．13±10．43、39．48±7．63；19．16±645、34．58±13．44；22．24±1237、43．73±16．87：1539±10．44、21．68±638，组间比较P>0．05。 3.正常人组、CHB．H组和CHB．L组imDC上TLR3的表达率分别为8．89±4．21、7．46±4．n、28．49±7．72，mDCs上TLR3的表达率分别为：正常人组5．71±4．33、CHB．H组6．68±3．17、CHB．L组6．15±3．88、。统计学分析结果：正常人imDCs上TLR3的表达率明显高于两组CHB患者，P0．05。正常人组imDCs上TLR3的表达率高于其mDCs，有显著性差异，P0．05。 4.CHB患者DCs上TLR3的表达与其外周血HBVDNA载量无明显相关性。CHB患者mDC上TLR3的表达与imDC无显著性差异(p>O．05)。 5.三组DCs的培养上清夜中ILl2的产量：正常对照组分别为：41．54±20．75、137．62±4338；CHB．H组分别为26．22±n．20、31．84±12．35；CHB．L组分别为3159±14．16、42．n±10．76，与正常对照相比较，两组CHB的DCs产生ILl2的水平降低(P<0．05)。 结论： 1.通过细胞因子组合IL4、GM．CSF体外培养扩增的DCs为imDC，经TNF—a处理后的DCs为mDCs； 2.CHB患者外周血DC上存在TLR3的表达减少； 3.DCs上TLR3的表达变化可影响CHB患者DCs的表型、功能； 4.CHB患者DCs上TLR3的表达变化与其外周血HBVDNA载量间无明显相关性； 5.CHB患者外周血DC上存在TLR3的表达缺陷，可能为DCs成熟障碍、功能下调的重要原因。

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