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脑源性神经营养因子在体外培养大鼠胚脑皮质神经元低氧适应中的保护作用

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前言

第一部分大鼠胚脑皮质神经元细胞的原代培养、鉴定和缺氧模型的建立

第二部分大鼠胚脑皮质神经元细胞缺氧损伤时的超微结构变化

第三部分 BDNF对体外培养大鼠胚脑皮质神经元缺氧的保护作用

第四部分 BDNF经由CREB的磷酸化对缺氧大鼠胚脑皮质神经元细胞的保护作用研究

综述

致谢

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摘要

第一部分：大鼠胚脑皮质神经元细胞的原代培养、鉴定和缺氧模型的建立 目的：进行大鼠胚脑皮质神经元细胞培养和鉴定，并建立大鼠胚脑皮质神经元细胞培养的缺氧模型。 方法：(1)运用胰蛋白酶和DNase I联合酶消化法，选择合适孔径的筛网过滤，并以L一多聚赖氨酸作为神经元体外培养的生长基质，进行大鼠胚脑皮质神经元的体外培养；(2)运用免疫荧光组织化学方法检测神经元特异的抗。rubulin βⅢ单克隆抗体和神经胶质细胞特异的抗GFAP多克隆抗体分别进行神经元细胞和神经胶质细胞的鉴定，检测体外培养大鼠胚脑皮质神经元细胞的纯度；(3)运用国产厌氧培养箱在37℃含85％N<,2>、5％C0<,2>、10％H<,2>混合气环境下建立大鼠胚脑皮质神经元细胞的缺氧模型。 结果：(1)通过体外培养获得了纯度达95％以上的大鼠胚脑皮质神经元细胞；(2)运用神经元特异的抗TLlbulin βⅢ单克隆抗体和神经胶质细胞特异的抗GFAP多克隆抗体分别鉴定神经元和神经胶质细胞的，星形胶质细胞沾染率<5％；(3)模拟缺氧环境建立了大鼠胚脑皮质神经元细胞的缺氧模型。 结论：应用胰蛋白酶和DNase Ⅰ联合酶消化法成功完成了大鼠胚脑皮质神经元细胞的体外培养，并运用国产厌氧培养箱在37℃含85％N<,2>、5％CO<,2>、10％H<,2>混合气体的条件下成功建立了大鼠胚脑皮质神经元细胞的缺氧模型。该方法简单、实用、可靠，是研究大鼠胚脑皮质神经元细胞在宫内缺氧时细胞损伤的有效方法和手段。 第二部分：大鼠胚脑皮质神经元细胞体外遭受缺氧损伤时的超微结构变化 目的：透射电镜下观察缺氧诱导大鼠胚脑皮质神经元损伤后的神经元细胞超微结构变化。 方法：对体外培养7天(DIV7)的成熟大鼠胚脑皮质神经元进行缺氧培养，分别收集正常和缺氧第2、4小时的皮质神经元细胞，制备透射电镜标本，并通过透射电镜观察缺氧诱导细胞损伤的超微结构变化。 结果：缺氧将造成神经元细胞的损伤，神经元细胞的坏死和凋亡不能概括神经元细胞死亡的全部方式，在同一细胞内发现了典型凋亡和坏死共存的超微结构特征。 结论：缺氧是造成神经元细胞损伤的重要因素，缺氧所致神经元细胞死亡类型和机制具有多样性。在超微结构上，可以发现神经元细胞的坏死、凋亡和混合型细胞死亡三种类型。 第三部分：BDNF对体外培养大鼠胚脑皮质神经元细胞缺氧的保护作用 目的：探讨外源性BDNF对遭受缺氧刺激的体外培养大鼠胚脑皮质神经元的保护作用。 方法：以神经元对缺氧最为敏感的第0—10h为研究时间(1)采用MTT比色法检测正常对照组(A组)、不同缺氧时间点皮质神经元缺氧对照组(B组)及缺氧培养前24h和缺氧即刻加入不同剂量外源性BDNF实验组(C组)神经细胞存活率差别；(2)采用DAPI染色法结合凋亡细胞的原位末端标记法(TLINEL)检测细胞凋亡率。 结果：加入BDNF实验组C组在缺氧0-6h时各时间点细胞活性显著高于缺氧对照组B组(P<0.01)，凋亡神经细胞百分率低于缺氧对照组B组(P<0.01)，且在缺氧极早期(O-2h)，BDNF大剂量干预组优于中剂量组，中剂量组优于小剂量组，提前24h加入BDNF干预组优于相同剂量即刻加入BDNF干预组，尤以大剂量组明显。随着缺氧时间延长，BDNF的保护作用逐渐减弱，到缺氧10小时，C组与B组比较细胞活性已无统计学意义。 结论：缺氧可诱导体外培养大鼠胚脑皮质神经元死亡，早期加入适量外源性BDNF可以使神经元对低氧的耐受性增强而发挥BDNF对神经元的保护作用。 第四部分: BDNF经由CREB的磷酸化对缺氧大鼠胚脑皮质神经元细胞的保护作用研究 目的：观察在缺氧不同时间点，单纯缺氧组和加入外源性BDNF干预的实验组(BDNF干预组)胚脑皮质神经元细胞内转录因子CREB及Ser<'133>。磷酸化CREB表达水平的变化，探讨BDNF经由CREB的磷酸化对缺氧大鼠胚脑皮质神经元细胞的保护作用。 方法：运用蛋白质免疫印迹法(Westernblotting法)检测单纯缺氧和BDNF干预组胚脑皮质神经元细胞内CREB及Ser<'133>磷酸化CREB在不同时间点表达水平的变化。 结果：缺氧及BDNF均能刺激胚脑皮质神经元细胞内Ser<'133>磷酸化CREB表达增加，在不同缺氧时间点，BDNF干预组Ser<'133>磷酸化CREB表达水平较单纯缺氧组明显增强(P<0.01)，BDNF干预组1h后Ser<'133>。磷酸化CREB表达达到高峰，以后持续表达达6h以上，维持时间较单纯缺氧组明显延长。在缺氧O-3h，细胞内总CREB表达水平BDNF干预组与单纯缺氧组基本一致，随着缺氧时间的延长，单纯缺氧组细胞内CREB表达明显减少，以5-6小时最明显。 结论：转录因子CREB是胚脑皮质神经元细胞内BDNF诱导基因表达的重要调节因子，BDNF对缺氧性神经元损伤的保护作用经过了核蛋白CREB的磷酸化。

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