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肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌mRNA表达谱的影响及通过抑制TRPP2的表达促进人喉鳞状细胞增殖的实验研究

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第一部分 肿瘤坏死因子α 对人喉鳞状细胞癌影响的mRNA表达谱的构建及分析

1前言

2材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 参考文献

第二部分 肿瘤坏死因子α 通过抑制TRPP2的表达促进人鳞状细胞癌细胞增殖的实验研究

1前言

2材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 结论

7 参考文献

附录

致谢

综述:炎症与肿瘤

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摘要

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1-5%，虽在全身恶性肿瘤中占据的位置不高，但在呼吸道及头颈部恶性肿瘤中的位置较为重要，在呼吸道恶性肿瘤中仅次于肺癌，占第二位，在头颈肿瘤中占第2-5位。喉癌多发生于40岁以上年龄人群，其中世界男女发病率之比大约为10:1，部分地区男女发病率差异略小，如我国东北地区男女发病率差异则小于世界水平。目前流行病学调查显示，吸烟和饮酒是喉癌发病的高危因素，但具体发病过程是个复杂的生物学变化，同所有的肿瘤一样，喉癌的发病和癌基因活化、抑癌基因失活有关，同时很多其它因素也可促进喉癌的发生和发展，如炎症状态、机体内离子通道功能改变等。喉癌的临床症状多表现为声音嘶哑、呼吸困难甚至吞咽困难等，若合并颈部淋巴结转移则表现为颈部包块。喉癌的病理类型大多数为鳞状细胞癌。目前喉癌的治疗提倡以手术治疗为主，结合放化疗的综合治疗方法，虽然喉癌的治疗经历了百余年的进展，喉癌发病及治疗的基础研究也在不停的进步，但喉癌患者的五年生存率及术后生存质量并未得到大幅改善。
　　瞬时受体电位通道超家族（transient receptor potential，TRP）是一种非选择性钙离子通道，在钙离子信号转导通路中起重要作用。TRP通道目前一般分为两大类，第一类包括 TRPA、TRPC、TRPN、TRPV，第二类包括 TRPP和TRPML，他们均具有类似的结构，结构中均有一内嵌的发卡通道结构，TRP通道分布广泛，主要通过介导的钙离子内流作用参与调节机体的机械感觉、痛觉、味觉、肌肉收缩、细胞增生、分化、凋亡等众多生理病理反应。但各种TRP通道的作用并不完全相同，部分TRP通道亚类可以相互或协同作用调节生命活动。
　　TRPP2通道作为TRP超家族中的一员，又称之为PKD2(polycystin-2)，目前研究较多和确实的证据认为TRPP2的突变与多囊肾的发病密切相关。TRPP2在多种组织中广泛表达，如血管内皮平滑肌细胞、上皮细胞、心肌细胞、肾上腺和卵巢细胞。目前研究认为TRPP2的亚细胞定位有一定的争议，认为可表达于细胞质膜、高尔基体、内质网和原纤毛中，其中内质网的定位最为认同。在内质网中，TRPP2作为细胞内钙离子释放的通道，联合三磷酸肌醇受体和雷尼丁受体调节胞内钙离子的平衡，参与钙库介导的钙离子内流过程（(store-operated calcium entry channels, SOCE），从而发挥各种生理和病理功能，如参与细胞增殖、凋亡、自吞噬等过程。
　　肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorɑ，TNF-ɑ）最初是以抗肿瘤因子被发现，是目前发现的最强的抗肿瘤因子，肿瘤坏死因α是一种多向性细胞因子，其在炎症反应、细胞分化、免疫调节以及抗感染、抗肿瘤方面有重要作用，但研究也表明肿瘤坏死因子α对肿瘤的作用因条件的不同可产生不同的结果，虽然是最强的抗肿瘤因子，但在某些情况下也可表现为促进肿瘤发生发展。
　　生物信息学是近年来广泛应用于临床与基础研究的一门交叉学科，它结合了信息学、计算机学、统计学等多种技术对大量的生物数据从分子水平通过序列对比、通路分析、生物聚类、统计分析等进行分析、筛选，发现疾病的异常信息，可作为进一步证实研究的筛选手段，避免盲目无效性的研究。
　　本研究应用人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系，通过表达谱测序、生物信息学技术、蛋白印迹、流式细胞术、细胞增殖实验、钙成像以及siRNA技术分两部分阐述了肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的mRNA表达谱的影响以及肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达及其介导的内质网上钙离子释放来增强人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系的增殖。为进一步阐明TRPP2和肿瘤坏死因子α在人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖中的作用以及相关机制提供新的依据，有助于阐明喉癌的发生发展过程，并有利于对喉癌开发新的潜在治疗方向，为治疗喉癌提供实验室证据。
　　1.肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞mRNA表达谱的影响及分析
　　既往研究发现肿瘤坏死因子α对肿瘤的作用是双方面的，因为条件的不同可表现为促进或抑制。为探讨肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的作用，本研究利用mRNA测序技术、生物信息学分析技术，揭示了TRPP2相关mRNA在肿瘤坏死因子α处理的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞PKD2基因的mRNA表达水平显著下降(和对照组相比)，由此推测分析肿瘤坏死因子α可能是通过下调TRPP2导致人喉鳞状细胞癌细胞增殖的改变。但结论需要进一步的实验研究。
　　2.肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达促进人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2增殖的实验研究
　　肿瘤坏死因子α和TRPP2都参与机体细胞的多种功能，研究表明，钙离子通道在肿瘤的发生发展中起重要作用，TRPP2作为钙离子通道中的一员，我们推测其在喉癌的增殖和发展中发挥着重要作用，通过第一部分的研究我们对经过肿瘤坏死因子α处理的人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2较对照组未处理的人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2在mRNA表达谱的分析中发现，TRPP2mRNA表达显著减少，为进一步验证TRPP2是否参与肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的影响过程，我们进行了进一步的机制研究。本研究结果表明肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达调节PERK-eIF2α信号通路以及TRPP2介导的钙离子通道途径增强了Hep-2细胞的增殖。主要结果如下：（1）肿瘤坏死因子α能显著减少人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的TRPP2的表达和ATP引发的钙离子释放。（2）siRNA特异敲低TRPP2可显著抑制ATP引发的钙离子释放、消除肿瘤坏死因子α对ATP引发的钙离子释放减少的效应。（3）人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞经过肿瘤坏死因子α处理或特异敲低TRPP2处理未影响IP3R-I表达水平和细胞内基础钙离子浓度。但肿瘤坏死因子α处理和特异性敲除TRPP2对抑制TRPP2的表达有增强效应。（4）肿瘤坏死因子α处理增强了人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖及G2/M期的比例，但是减少了G0/G1的比例。而siRNA特异敲低TRPP2后，人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖也增加，其表现为S期和G2/M期比例增加，但G0/G1期细胞比例减少。（5）肿瘤坏死因子α显著下调p-PERK和 p-eIF2α的表达水平，但不影响PERK和eIF2α的表达水平。

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