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半成熟树突状细胞(smDC)激活抗原特异性CD4CD25调节T细胞延长小鼠移植皮瓣存活时间

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摘要

研究背景和目的：
　　 树突状细胞(dendritic cells，DCs)是专职的抗原提呈细胞，在移植免疫识别中起关键作用。DCs发育阶段不同，在移植免疫反应中的作用也不同。已经证实未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)在器官移植中诱导外周免疫耐受，而成熟树突状细胞(mature dendritic cells，mDCs)则激发免疫排斥反应。目前认为，DCs的分子表型和细胞因子表达格局是决定其功能的主要因素。imDC低表达MHC-II，不表达或低表达CD40、CD80和CD86等共刺激分子、不分泌IL-1、IL-6和IL-12等炎性细胞因子，因此进入受体时激活抗原特异性CD4+CD25+Treg(Tregulatory cell，Tr)，从而引起免疫耐受；而mDC因高表达MHC-II、CD40、CD80和CD86等共刺激分子，同时分泌IL-1、IL-6和IL-12等炎性细胞因子，进入受体激活效应性T细胞而引起免疫排斥反应。但是，将DC分成imDCs和mDCs的概念近年受到挑战。已有的研究表明存在独特免疫功能的中间状态DCs，学者们将这-DCs亚群命名为半成熟树突状细胞(semimature Dendritic Cells，smDCs)，其分子表型与imDCs和mDCs均有明显差异、如高表达MHC-II，而中度表达CD40、CD80和CD86等共刺激分子，但其不分泌IL-1、IL-6和IL-12等细胞因子。研究证实回输小鼠骨髓源性smDC可以抑制或者治愈自身免疫性疾病，其机制是smDCs进入体内激活CD4+CD25+Treg而实现的。但是，smDCs在器官移植免疫耐受中的作用和机制仍然不清。为了探索smDCs在器官移植免疫耐受中是否与CD4+CD25+Treg存在紧密的纽带关系、以及smDCs致移植免疫耐受的具体作用和机制，跟课题采用供体髓源性smDC预处理受体，考察其能否激活抗原特异性CD4+CD25+Tr而实现受体对供体移植物的免疫耐受状态，进而明显延长移植物的存活时间。我们的研究为进一步研究smDCs在移植免疫耐受中的作用和机制提供实验依据，并开启一条新的诱导免疫耐受的途径。
　　 材料与方法：
　　 1.实验动物
　　 供体：C57BL/6J小鼠(H-26)：
　　 受体：BALB/c小鼠(H-2d)；
　　 第三方抗原：DBA2小鼠(H-2d)。
　　 2.C57BL/6J小鼠骨髓smDC的诱导培养
　　 获取C57BL/6J小鼠(供体)骨髓细胞，以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和小鼠重组白细胞介素(IL)-4诱导培养获得imDC样本，然后分别以肿瘤坏死因子(TNF-a)和脂多糖(LPS)刺激获得半成熟树突状细胞(smDC)和成熟树突状细胞(mDC)样本。
　　 3.imDC、srnDC和mDC的签定
　　 以imDC和mDC为对照，光镜和电子显微镜观察smDC形态特征；流式细胞技术(FCM)检测imDC，smDC和mDC表达MHC-II(I-Ab)，CDllc，CD40，CD80和CD86情况；ELISA方法检测三种DCs样本IL-1β，IL-6，IL-12p70和IL-10的分泌情况；建立供受体单向混合淋巴细胞反应模型(MLR)，CCK-8检测imDC、smDC和mDC对异基因淋巴细胞的激活能力。
　　 4.分离提纯供体smDC体内激活的受体CD4+CD25+Tr
　　 用供体smDC预处理受体BALB/c小鼠，同时设立PBS对照组。21d时以Miltenyi磁株分选系统(MACS)分选脾脏CD4+CD25+Tr和CD4+CD25-Tr细胞；体外扩增CD4+CD25+Tr，FCM检测扩增前后CD4+CD25+Tr纯度、GITR和CTLA-4的表达。RT-PCR检测扩增的CD4+CD25+Tr特异性Foxp3基因表达。
　　 5.供体smDC激活受体CD4+CD25+Tr对效应性T细胞的抑制作用
　　 以受体CD4+CD25-T细胞为反应细胞，分5组建立单向MLR(每组设6孔，即n=6)：供体smDC预处理CD4+CD25+Tr(smDC)组、PBS预处理处理CD4+CD25+Tr(PBS)组、第三方抗原(DBA2)组、阳性对照(PC)组和阴性对照(NC)组。smDC和PBS组分别加入smDC和PBS预处理的CD4+CD25+Tr，反应72h后ELISA检测11-1β、IL-2、IL-6和IL-10表达水平，CCK-8检测细胞增值情况，光镜和原子力显微镜(AFM)观察反应细胞和刺激细胞间的作用关系。
　　 6.供体smDC激活受体CD4+CD25+Tr对移植皮瓣存活时间影响
　　 6.1.建立皮肤移植模型
　　 分12组，每组n=12
　　 自身对照组：同基因C57BL/6J小鼠为供受体，14d时移植皮瓣存活>91.7％(11/12)视为有效。旨在检验模型建立是否成功，相关数据不纳入统计分析。
　　 C57BL/6J→BALB/c皮瓣移植：C57BL/6J小鼠为供体，BALB/c小鼠为受体，分为：
　　 smDC组：术前用C57BL/6J小鼠(供体)smDC预处理BALB/c小鼠(受体)；
　　 CD4+CD25+Tr(smDC)组：术后输注供体smDC激活受体CD4+CD25+Treg
　　 CD4+CD25+Tr(PBS)组：术后输注PBS对照预处理的受体CD4+CD25+Treg；
　　 control组：空白对照组，供体和受体移植前后均不做任何处理。
　　 C57BL/6J→BALB/c小鼠+雷帕霉素(Rapa)皮瓣移植：C57BL/6J小鼠为供体，BALB/c小鼠为受体。除每组术后Rapa灌胃外，其余处理同上述相应四组。分为：smDC+Rapa.组；CD4+CD25+Tr(smDC)+Rapa.组；CD4+CD25+Tr(PBS)+Rapa.组和Rapa.alpne组。
　　 DBA2→BALB/c小鼠+Rapa皮瓣移植：DBA2小鼠为供体，BALB/c小鼠为受体，术每日后Rapa灌胃，受体处理同前述相应三组。分为：smDC+Rapa.组；CD4+CD25+Tr(smDC)+Rapa.组和Rapa.alpne组。
　　 6.2.模型观察指标：
　　 每组随机抽取6只用于观察皮片脱落时间，用Kaplan-Meier曲线进行皮瓣生存分析。另外6只用于检测CD4+细胞的浸润、HE染色后根据Zdichavsky分级标准判断皮瓣排斥反应、ELISA检测皮瓣内表达IL-2，IL-4和IL-10的情况；FCM检测脾脏CD4+CD25+Tr比率。
　　 结果：
　　 1.smDC形态和表型特征
　　 2.smDC不分泌炎症细胞因子
　　 3. smDC体外不活化异基因淋巴细胞
　　 4.提取供体smDC激活的受体CD4+CD25+Tr
　　 5.供体smDC激活受体CD4+CD25+Tr对制效应性T细胞的特异性抑作用
　　 6.供体smDC激活受体CD4+CD25+Tr特异性延长受体移植皮瓣存活时间
　　 结论：
　　 1、smDC形态介于imDC和mDC之间，高水平表达MHC-II，低度或中度表达CD40，CD80和CD8，不分泌IL-1β，IL-6和IL-12；不活化异基因淋巴细胞。因此smDCs是功能和形态相对独立的树突状细胞亚群
　　 2、供体smDC可激活受体CD4+CD25+Treg，后者分泌IL-10抑制效应性T细胞对抗原刺激的反应能力，从而诱导免疫耐受；
　　 3、供体smDC预处理受体可能引起Th1/Th2向Th2方向偏移；
　　 4、供体smDC预处理受体是潜在的诱导免疫耐受的有效途径。

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