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RhoA/Rho激酶信号通路在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用

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摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学方法

结果

1 心肌细胞活力

2 心肌细胞的鉴定

3 高糖和法舒地尔对心肌细胞凋亡的影响

4 高糖和法舒地尔对心肌细胞周期的影响

5 高糖和法舒地尔对ROCK活性的影响

6 高糖和法舒地尔对Bax／Bcl-2比值和caspase 3蛋白表达的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 RhoA／Rho激酶信号通路在心肌病发病机制中的作用

致谢

个人简历

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摘要

目的:糖尿病性心肌病(DC)，是糖尿病慢性并发症之一，主要表现为心室舒张功能受损，最终发展为心力衰竭，这与糖尿病患者心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关。心肌细胞凋亡在DC的形成中起着重要作用，是DC主要的病理特征之一。因此，更好地了解高血糖状态下心肌细胞凋亡的发病机制，为DC的防治提供新的策略是非常必要的。RhoA/Rho激酶(ROCK)信号通路有着“分子开关”的作用，调节着细胞的收缩、粘附、增殖和凋亡等多种生物学行为和功能。有研究表明在心肌缺血再灌注损伤中，ROCK介导了心肌细胞凋亡。本研究通过观察体外高糖条件下心肌细胞的凋亡情况并应用ROCK特异性抑制剂法舒地尔进行干预，探讨RhoA/ROCK通路在诱导心肌细胞凋亡中的作用，旨在为DC提供一个新的治疗靶点。
　　方法:取出生后1-3天的SD大鼠，组织消化法进行心肌细胞体外培养，台盼蓝染色法进行心肌细胞活力鉴定，采用细胞免疫化学法进行心肌细胞鉴定。将心肌细胞分为9组:正常对照组（NG:含5.5mmol/L葡萄糖）、高糖组（HG:含25mmol/L葡萄糖）、高渗透压组（OSM:5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、正常糖浓度+法舒地尔组（50、75和100μmol/L）、高糖浓度+法舒地尔组（50、75和100μmol/L），培养72小时。采用流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率并分析细胞周期，应用Westernblotting检测磷酸化MYPT1水平、Bax/Bcl-2、caspase3蛋白表达。
　　结果:
　　1、高糖和法舒地尔对心肌细胞凋亡的影响:从流式结果分析，与对照组相比，高糖组心肌细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01）;与高糖组比较，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，细胞凋亡率显著降低(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)，且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05);当高糖中加入法舒地尔100μmol/L时，凋亡率与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔(50、75和100μmol/L）与对照组相比细胞凋亡率无显著性差异(P＞0.05)。
　　2、高糖和法舒地尔对心肌细胞周期的影响:从细胞周期结果分析，与对照组相比，高糖组心肌细胞处于G0期细胞数量显著升高(P＜0.01);与高糖组相比，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，G0期细胞数量显著下降(P＜0.01)，且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05);高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。高糖组G2期细胞数量较对照组显著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，G2期细胞数量较高糖组显著升高(P＜0.01)，且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05);当法舒地尔浓度为100μmol/L时，与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。高糖组S期细胞数量较对照组显著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，S期细胞数量较高糖组显著升高(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)，且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05);当法舒地尔浓度为100μmol/L时，与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）时G2期、S期细胞数量与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。
　　3、高糖和法舒地尔对ROCK活性的影响:肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)是ROCK的主要底物之一，磷酸化的MYPT1是ROCK信号通路激活的标志，因此检测磷酸化MYPT1水平来反应ROCK的活性。与对照组相比，高糖组磷酸化MYPT1水平显著升高(P＜0.01)。与高糖组相比，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）显著抑制了磷酸化MYPT1水平的增加(P＜0.01);且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05);高渗透压组及正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。
　　4、高糖和法舒地尔对Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达的影响:各组Bcl-2表达无明显差异(P＞0.05);与对照组相比，高糖组Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达显著升高(P＜0.01);在高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L），Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达较高糖组显著下降(P＜0.01)，且三组之间两两比较有统计学差异(P＜0.05)。当高糖中加入法舒地尔100μmol/L时与对照组比较无显著性差异（P＞0.05);高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比，Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达无显著差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、高糖能够诱导心肌细胞凋亡并将细胞周期阻滞于G0期;
　　2、高糖通过激活RhoA/ROCK信号通路，上调Bax和casepase3表达从而介导了心肌细胞凋亡;ROCK抑制剂法舒地尔能够抑制ROCK活性，浓度依赖性地抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。

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