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【6h】

一.TNFR1死亡和/或非死亡结构域与tmTNF-α杀伤靶细胞的关系探讨二.选择性亲和TNFR1/TNFR2的tmTNF-α突变体重组质粒的构建和TNFR1突变体重组质粒的构建

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第一部分:TNFR1死亡和/或非死亡结构域与tmTNF-α杀伤靶细胞的关系探讨
　　肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)分为两型:游离型TNF-α(sTNF-α)和跨膜型TNF-α(tmTNF-α),tmTNF-α为sTNF-α的前体形式,以II型膜蛋白表达在细胞膜上,通过TNF转化酶(TACE)的剪切形成sTNF-α。
　　肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)属于TNFR超家族,其胞内段C末端含有由80个保守氨基酸序列所构成的死亡结构域(Death domain,DD),这个保守结构域对于TNFR传递程序性凋亡信号是必不可少的,因此TNFR也被称为死亡受体。TNFR也分为两个亚型:TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b),两型受体均可以和配体(肿瘤坏死因子α,tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)结合,发挥不同的生物学效应。
　　TNFR1是介导两型TNF-α诱导凋亡的主要受体,但是两型 TNF-α的生物学作用不尽相同:TNFR1的内化为sTNF-α诱导凋亡所必须,而tmTNF-α是锚定在细胞膜上的II型蛋白,通过细胞与细胞接触发挥效应,内化可能并不是tmTNF-α诱导凋亡的必须条件。目前sTNF-α通过TNFR1介导的凋亡信号通路已基本明确,内化结构域(TRID)、死亡结构域(DD)和非死亡结构域-中性鞘磷脂酶结构域(NSD),上述三个结构域在TNFR1介导sTNF-α凋亡信号途径中发挥着重要作用,而tmTNF-α的凋亡信号通路却知之甚少。为阐明 tmTNF-α通过 TNFR1所介导的凋亡信号途径,本研究以 TNFR1及上述三种重要结构域缺失的TNFR1突变体为实验工具,观察tmTNF-α诱导凋亡是否依赖 TNFR1的内化结构域,死亡结构域以及中性鞘磷脂酶结构域,以明确TNFR1的死亡结构域和/或非死亡结构域在tmTNF-α诱导细胞凋亡的信号途径中发挥的作用。
　　本研究主要结果如下:
　　一.从受体角度证实:tmTNF-α可通过TNFR1介导细胞凋亡,但与sTNF-α不同,TNFR1死亡和非死亡结构域均不参与其凋亡信号通路。
　　1.tmTNF-α可通过TNFR1介导细胞凋亡,但内化结构域(TRID)、死亡结构域(DD)和非死亡结构域-中性鞘磷脂酶结构域(NSD)不介导tmTNF-α的凋亡信号通路。
　　2.TNFR2参与tmTNF-α的凋亡效应,但是并不影响tmTNF-α通过TNFR1介导靶细胞凋亡的信号通路。
　　3.与sTNF-α不同,中性鞘磷脂酶结构域(NSD)和神经酰胺(ceramide)不参与tmTNF-α通过TNFR1介导的凋亡信号途径
　　二.从配体角度再次验证tmTNF-α可以通过TNFR1介导细胞凋亡,但是TNFR1死亡和非死亡结构域均不参与其凋亡信号通路。
　　结论:分别从受体和配体角度证实,TNFR1是tmTNF-α诱导凋亡的主要受体, TNFR2可能也参与tmTNF-α的凋亡通路,但是tmTNF-α完全不同于sTNF-α,其对靶细胞的杀伤作用并不依赖 TNFR1的内化结构域(TRID)、死亡结构域(DD)和中性鞘磷脂酶结构域(NSD)。
　　第二部分选择性亲和TNFR1/TNFR2的tmTNF-α突变体重组质粒的构建和TNFR1突变体重组质粒的构建
　　一、选择性亲和TNFR1/TNFR2的tmTNF-α突变体重组质粒的构建
　　肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是一种具有多效生物学活性的细胞因子,可介导增殖、分化、凋亡等各种生物学效应。作为II型膜蛋白,TNF-α首先以26KD跨膜型TNF-α(transmembrane tumor necrosis factor-alpha, tmTNF-α)的前体形式表达在细胞膜上,经TNF转化酶剪切后形成17KD的游离型TNF-α(secretory TNF-α, sTNF-α)。
　　TNF-α的生物学效应由细胞表面两种不同的受体所介导:TNF受体1(TNFR1)和TNF受体2(TNFR2),但TNF-α与两型受体结合后的生物学作用不尽相同,而且与两型受体的亲和性也存在差异。
　　本研究拟通过重叠PCR的方法将tmTNF-α胞外段结构域第32位精氨酸突变为色氨酸(R32W-tmTNF-α),使该突变体与 TNFR2亲和性显著下降,但是不影响其与TNFR1的亲和性。另外,采用普通PCR方法将tmTNF-α胞外段结构域第143位天冬氨酸突变成为天冬酰胺(D143N-tmTNF-α),使该突变体与TNFR1亲和性大幅下降,但是不影响其与TNFR2的亲和性。然后将上述两种TNFR1和TNFR2选择性亲和力突变体分别定向克隆到pIRES2-EGFP载体,为后续研究tmTNF-α的信号转导通路打下基础。
　　二、TNFR1突变体重组质粒的构建
　　肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)为TNF-α天然受体,分为两种亚型:TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b),两型受体均以I型膜蛋白的形式表达在细胞膜上。TNF-α通过和两型受体结合,激活一系列信号分子,介导生物学效应。TNFR1是sTNF-α发挥生物学活性的主要受体,二者结合后通过TNFR1特定的胞内结构域,介导促进细胞生存和诱导细胞凋亡两种截然相反的细胞效应,但是tmTNF-α是以膜蛋白的形式与 TNFR1结合,其具有的信号转导机制可能和sTNF-α有所不同,尚未阐明。
　　TNFR1胞内段主要包括死亡结构域(death domain,DD)、内化结构域(internalization domain,TRID)和中性鞘磷脂酶结构域(neutral sphingomyelinase domain,NSD),这三个结构域在sTNF-α信号通路中均发挥着重要的作用。
　　本研究拟通过重叠PCR法将TNFR1胞内段236位酪氨酸突变成为丙氨酸(Y236A-TNFR1)使TNFR1丧失内化功能、缺失胞内338-348位氨基酸((A)NSD-TNFR1)使TNFR1丧失中性鞘磷脂酶结构域。将两种突变体分别定向克隆到pTriEx4.OHis-N1载体上，转染HEK293细胞，进行后续的细胞生物学功能实验，以观察缺失相应结构域的TNFR1对于介导tmTNF-α信号通路是否具有差异，从而为进一步研究tmTNF-α信号转导通路奠定基础。

著录项

作者
胡雪娜;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科分子免疫学
授予学位硕士
导师姓名李卓娅,王晶;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肿瘤病理解剖学、组织学;
关键词
肿瘤坏死因子α; 杀伤靶细胞; 结构域; 突变体重组质粒;

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