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FSTL1通过增强气道上皮细胞自噬促进哮喘气道上皮间质转化及气道重塑

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摘要

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前言

第一部分 哮喘患者气道上皮细胞自噬及FSTL1表达的研究

引言

材料方法

结果

讨论

小结

第二部分 FSTL1通过DIP2A受体增强上皮细胞自噬进而促进EMT机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 体内阻断FSTL1及自噬对于哮喘小鼠气道EMT和重塑的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

结果附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文

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摘要

目的：
　　探究FSTL1与细胞自噬介导哮喘气道重塑的具体机制，发现可能阻断上述通路进而减轻哮喘气道重塑的有效作用靶点。
　　方法：
　　1.哮喘患者气道上皮细胞自噬及FSTL1的表达
　　2.FSTL1通过DIP2A受体增强上皮细胞自噬进而促进EMT的机制研究
　　2.1 小干扰RNA(si-RNA)转染:运用Lipofectamine3000转染试剂，向人气道上皮细胞系16HBE细胞转染si-RNA(si-DIP2A、si-ATG5、si-NC)。此部分实验分组情况如下:对照组，FSTL1刺激组(FSTL1100ng/ml)，si-NC对照组（转染si-NC），si-DIP2A组(转染si-DIP2A)，FSTL1+si-NC组，FSTL1+si-DIP2A组。
　　2.2 16HBE细胞的刺激及抑制剂处理分组:对照组，FSTL1刺激组(FSTL1100ng/ml),LY-294002刺激组(LY-29400210uM),FSTL1+LY-294002组(FSTL1100ng/ml+LY-29400210uM)。
　　2.3 FSTL1及阻断其受体DIP2A对气道上皮细胞EMT的影响:给予16HBE细胞FSTL1刺激及转染siRNA干扰受体DIP2A的表达后，Western blot方法检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物N-Cadherin、vimentin、collagenⅠ及α-SMA的表达，同时采用transwell迁移实验观察FSTL1.刺激及si-DIP2A对细胞迁移能力的影响。
　　2.4 自噬抑制剂对FSTL1介导的上皮细胞自噬及EMT的影响:采用人气道上皮细胞系16HBE细胞，给与FSTL1刺激及LY-294002作用后，采用透射电子显微镜观察细胞自噬小体的表达情况;另外，将16HBE细胞进行GFP-LC3慢病毒转染后，给予16HBE细胞FSTL1刺激及LY-294002作用，在倒置荧光显微镜下观察LC3B颗粒状聚集情况，以明确细胞自噬水平的高低;同时western blot检测细胞自噬标记物beclin1的表达水平及LC3BⅡ/LC3BⅠ表达水平。同时western blot检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物N-Cadherin、vimentin、collagenⅠ及α-SMA的表达，明确FSTL1及LY-294002对于细胞EMT标记物蛋白表达水平的影响;细胞免疫荧光检测E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin的定位表达;另外，通过transwell实验、细胞胶原凝胶收缩实验检测FSTL1及LY-294002对细胞迁移能力及收缩能力的影响。
　　2.5 敲除自噬相关基因ATG5对FSTL1介导的上皮细胞EMT的影响:给予16HBE细胞FSTL1刺激及转染siRNA干扰自噬相关基因ATG5的表达后，Western blot方法检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物N-Cadherin、vimentin、collagenⅠ及α-SMA的表达。
　　3.体内阻断FSTL1及自噬对于哮喘小鼠气道EMT和重塑的影响
　　3.1 实验动物分型:①C57BL/6野生型(wide type，WT)小鼠;②Fst11flox/+小鼠;③cmv-Cre小鼠;④Fstl1+/-小鼠:Fstl1flox/+小鼠与cmv-Cre小鼠交配，通过对后代小鼠进行基因型检测，获得Fstl1+/-小鼠。
　　3.2 实验动物造模:①采用ovalbumin(OVA)致敏加激发的方法。方法如下:致敏阶段小鼠分别于第0天、14天腹腔注射100ugOVA加氢氧化铝2mg，一起溶于200ul磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）中;激发阶段采用滴鼻方式（200ugOVA溶于20ul PBS中），分别于第21、23、25天及第28天后每周两次滴鼻激发，连续4周;②FSTL1及FSTL1+LY-294002干预小鼠模型:A、FSTL1干预:采用10ugFSTL1（溶于50ulPBS中）滴鼻干预的方式，每天1次，连续干预15天;B、LY-294002干预:在FSTL1干预之前2h，腹腔注射LY-294002(给药剂量与小鼠体重相关，按7.5mg/kg给药)。
　　对照组小鼠采用相同给药方式给与相同体积的PBS。
　　3.3 实验动物分组:对照-WT组，OVA-WT组;OVA-Fstl1flox/+组，OVA-Fstl1+/-组;FSTL1-WT组，FSTL1+LY-294002-WT组。
　　3.4 小鼠肺功能检测各组小鼠气道反应性情况。
　　3.5 H&E、PAS(Periodic Acid-Schiff)染色检测小鼠气道基本病理表现。
　　3.6 酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血浆及肺泡灌洗液中FSTL1的表达水平。
　　3.7 透射电子显微镜观察小鼠气道黏膜组织自噬小体表达情情况。
　　3.8 免疫组织化学检测小鼠气道FSTL1、beclin、E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin、fibronectin、α-SMA的表达情况。
　　结果：
　　1.哮喘患者气道重塑程度升高，并伴有上皮细胞自噬及FSTL1的表达升高。
　　1.1 哮喘组病人与对照组年龄上无统计学差异，性别构成相同。哮喘组患者气道黏膜呈现上皮完整性破坏、上皮下基底膜明显增厚、杯状细胞增生等气道重塑表现。Trichrome染色发现哮喘组患者气道组织中胶原纤维明显增多。
　　1.2 免疫组化结果显示哮喘患者气道黏膜组织中FSTL1高表达，同时伴随上皮标记物E-Cadherin表达降低、间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物fibronectin、α-SMA的表达增高;采用免疫荧光方法对FSTL1及E-Cadherin双染，进一步明确FSTL1在哮喘患者气道内的定位表达，发现与对照组相比，FSTL1除在间质高表达外，还可表达于哮喘患者的气道上皮细胞，而哮喘患者气道上皮细胞内的E-Cadherin表达则减少。
　　1.3 哮喘组患者气道上皮自噬标记物beclin1表达水平增高;同时，运用电子透射显微镜观察气道粘膜组织，发现哮喘组患者气道黏膜上皮细胞内有大量的自噬小体。
　　2.FSTL1通过DIP2A受体增强16HBE上皮细胞自噬水平进而促进EMT
　　2.1 FSTL1介导气道上皮细胞EMT标记物表达变化。FSTL1可刺激上皮细胞间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物collagenⅠ、α-SMA表达增多，并介导E-Cadherin表达减少，并且呈时间浓度依赖性。
　　2.2 FSTL1通过DIP2A介导气道上皮细胞EMT变化。通过siRNA阻断DIP2A的表达，可发现si-DIP2A可减弱FSTL1介导的16HBE细胞间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物collagenⅠ、α-SMA的表达增多，并抑制E-Cadherin的表达减少(P＜0.05)，同时阻断DIP2A后，通过transwell迁移实验发现细胞的迁移能力也降低(P＜0.05)。
　　2.3 FSTL1可促进上皮细胞自噬。FSTL1刺激16HBE细胞后，细胞内自噬小体数量较对照组明显增加;同时稳定转染GFP-LC3B的16HBE细胞在给予FSTL1刺激后，细胞内LC3B颗粒状聚集现象明显，自噬标记物beclin1及LC3BⅡ/LC3BⅠ表达增多(P＜0.05)。而给予自噬抑制剂LY-294002后，LY-294002可抑制FSTL1介导的自噬小体增多及GFP-LC3B在细胞内的聚集(P＜0.05)，同时LY-294002可降低FSTL1介导的细胞自噬标记物beclin1的表达水平及LC3BⅡ/LC3BⅠ表达水平的比值降低(P＜0.05)。
　　2.4 抑制细胞自噬可降低FSTL1介导的上皮细胞EMT。LY-294002作用后，细胞内的EMT上皮标记物E-Cadherin表达上调、间质标记物N-Cadherin、vimentin表达下调，重塑标记物collagenⅠ、α-SMA表达亦下调(P＜0.05)。Transwell实验结果显示与FSTL1单纯刺激组相比，FSTL1+LY-294002组细胞的迁移能力下调(P＜0.05);同时通过胶原凝胶收缩实验，观察到LY294002同时还抑制了FSTL1介导的细胞收缩水平的下调(P＜0.05)。另外，通过si-ATG5干扰自噬后，亦发现细胞内的EMT上皮标记物E-Cadherin表达上调、间质标记物N-Cadherin、vimentin表达下调，重塑标记物collagenⅠ、α-SMA表达亦下调(P＜0.05)。
　　3.体内阻断FSTL1及自噬对于哮喘小鼠气道EMT和重塑的影响
　　结论：
　　1.哮喘患者气道粘膜组织存在重塑表现，并且伴随气道上皮细胞FSTL1表达增多及上皮细胞内自噬水平增高。
　　2.体外实验中，FSTL1可通过DIP2A受体介导气道上皮细胞自噬进而促进上皮细胞EMT。
　　3.动物实验中，Fstl1+/-敲除及LY-294002干预细胞自噬均可降低气道EMT及重塑表现。

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