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非综合征型耳聋患者基因突变热点筛查及一个耳聋家系MYO7A基因新突变分析

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第一部分 滕州市156例非综合征型耳聋患者临床资料分析及SNPscanTM法GJB2、SLC26A4及mtDNA12S rRNA基因突变热点筛查

研究背景

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 一个常染色体隐性遗传非综合征型耳聋家系MYO7A基因新突变的鉴定分析

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

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攻读博士学位期间发表的文章

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摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 滕州市156例非综合征型耳聋患者临床资料分析及SNPscanTM法GJB2、 SLC26A4及mtDNA12SrRNA基因突变热点筛查
　　目的:听觉功能障碍是一种常见的原因复杂的感觉功能障碍，在新生儿中的发生率约为1∶1000，其中半数为遗传性因素导致。有研究表明我国最常见的致聋病因是GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA基因突变。但到目前为止，我国的大部分地区还没有针对耳聋人群进行系统的遗传学调查分析的研究数据。本研究针对滕州地区非综合征耳聋人群的分子遗传学病因进行了流行病学调查，目的分析此地区的耳聋基因热点突变谱系及发生频率。
　　方法:依据纳入标准和排除标准筛选滕州地区遗传性重度和极重度非综合征型耳聋患者作为研究对象，通过填写“耳聋患者信息登记表”和电话寻访等方式采集患者及其家系病史，完善患者的耳聋相关检查（包括:一般体格检查、耳鼻喉科专科查体、听力学检查、影像学检查），获取耳聋患者的外周血标本，提取全血基因组DNA，利用SNPscanTM检测技术进行多重快速遗传筛查，检测GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA三个基因的115个常见的等位基因突变位点，最后使用SPSS20.0软件进行统计学分析，总结比较在此耳聋人群中发现的耳聋等位基因突变热点的检出率，寻找滕州地区耳聋患者的热点突变。
　　结果:筛选出的156例重度及极重度非综合征型耳聋患者全部为汉族，其中男性（93例）多于女性（63例），性别比为:1.476∶1;散发病例(129例，占82.69％)多于家系病例(27例，占17.31％)。通过SNPscanTM检测滕州地区156例非综合征型耳聋患者基因突变携带率是47.44％(74/156)，其中GJB2基因突变检出率最高26.92％(42/156)，其次是SLC26A4基因17.95％(28/156)，mtDNA12SrRNA基因为2.56％(4/156)。明确耳聋基因病因的患者占38.46％(60/156)，GJB2基因是该人群首要的致病基因(22.44％，35/156)，其次为SLC26A4基因(13.66％，22/156)和mtDNA12S rRNA基因(2.56％，4/156)。共检测出三个常见基因的27个突变位点和27种不同的等位基因组合方式。检出率最高的等位基因突变位点是GJB2基因c.235delC(12.8％，40/312)、SLC26A4基因c.IVS7-2A＞G(5.77％，18/312)。42例携带GJB2基因突变患者涉及等位基因突变位点11个，突变组合方式11种。明确GJB2为其耳聋病因的35例患者中GJB2纯合突变18例，占51.43％(18/35)，包括GJB2 c.235delC纯合突变型14例;GJB2 c.299_300delAT纯合突变型3例;GJB2 c.109G＞A纯合突变型1例。GJB2复合杂合突变17例，占48.57％(17/35)，包含7种复合杂合突变组合类型。携带SLC26A4基因突变患者28例涉及SLC26A4等位基因突变位点14个，突变组合方式16种。明确SLC26A4为其耳聋病因的21例患者中其中纯合突变4例，占19.04％(4/21)，包括c.IVS7-2A＞G纯合突变2例;c.2168A＞G纯和突变2例。SLC26A4复合杂合突变17例，占80.95％(17/21)，包含14种复合杂合突变类型。携带mtDNA12S rRNA基因突变患者4例涉及mtDNA12S rRNA突变位点2个，其中m.1555A＞G突变3例，占75％(3/4);m.1494C＞T突变1例，占25％(1/4)。
　　结论:采用SNPscanTM检测技术对滕州地区非综合征耳聋人群进行GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA三个基因的突变热点检测准确高效，检出率较高，与我国的其他地区相似，但不同突变位点的检出频率上存在着差别。GJB2和SLC26A4基因突变依然是滕州地区耳聋的主要致病基因。由GJB2基因突变致病的最多，SLC26A4基因突变次之，mtDNA12S rRNA基因较少。滕州地区耳聋地区等位基因突变呈现集中趋势和多元化，该地区的致聋基因热点突变为:GJB2基因的c.235delC、c.299-300delAT、c.176_191del16、c.109G＞A; SLC26A4基因的c.IVS7-2A＞G、c.2168A＞G、c.1226G＞A; mtDNA12S rRNA基因的m.1555A＞G。其中最常见的耳聋基因突变位点是GJB2 c.235delC和SLC26A4 c.IVS7-2A＞G。对耳聋患者及高危人群进行耳聋基因突变热点的分子遗传学筛查是预防和控制滕州地区遗传性耳聋的首要步骤，在此基因诊断的基础上再结合产前诊断、用药指导、临床干预可有效减少滕州地区耳聋的发生，同时也对山东省的耳聋基因谱的绘制提供数据信息。
　　第二部分 一个常染色体隐性遗传非综合征型耳聋家系MYO7A基因新突变鉴定分析
　　目的:MYO7A基因突变与综合征性耳聋(USH1B)和非综合征型耳聋(DFNB2，DFNA11)相关。MYO7A基因突变多数导致USH综合征，而只有很少的突变导致DFNB2和DFNA11。利用SNPscanTM检测技术对滕州市遗传性非综合征型耳聋27个家系进行多重快速遗传筛查，检测GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA三个基因的115个常见的等位基因突变位点，其中有13例耳聋家系未检测到常见的突变位点。本研究的目的是研究一个常染色体隐性遗传非综合征型耳聋家系可能的致聋基因突变位点。
　　方法:针对此常染色体隐性遗传非综合征型耳聋的中国家庭，首先用调查问卷采集一个中国家庭两位先天性耳聋患者的相关病史，纯音测听检测患者及家庭成员的耳聋程度及类型，前庭功能检查、眼科检查、颞骨CT及颅脑MRI排除其他疾病。采集全部家庭成员的外周静脉血6ml，提取全血基因组DNA。然后，采用目标基因捕获及新一代测序方法检测患者全血基因组DNA，寻找可能导致耳聋的新的基因突变位点。再经Sanger测序检测全部家庭成员DNA，120例正常人的DNA作为对照，来验证新的基因突变位点。并与11种种系的突变位点对应蛋白氨基酸结构区域进行比对，确定新的基因突变位点对应区域结构的保守性。最后，利用软件分析突变位点引起蛋白结构域的改变，推测突变引起的氨基酸改变及可能的功能变化。
　　结果:常染色体隐性遗传非综合征型耳聋的中国家庭的患者均呈出生后出现的双侧对称性极重度感音神经性耳聋。此家系内耳聋患者无视力障碍等综合征性耳聋的表现。目标基因捕获及新一代测序发现了MYO7A基因的一个新的复合杂合突变:c.3671C＞A(p.A1224D)和c.390_391insC(p.P81PfsX9)。其中c.3671C＞A(p.A1224D)是新的位点，c.390_391insC(p.P81PfsX9)是已被报道过的位点。患者的耳聋表型与DFNB2的表型一致。Sanger测序证实:在这个耳聋家系中，此新的复合杂合突变c.3671C＞A(p.A1224D)和c.390_391insC(p.P81PfsX9)与其耳聋症状存在共分离现象。对120例正常人检测均未见此复合杂合突变。与11种种系蛋白氨基酸结构区域比对证明其具有高度的保守性。利用软件分析c.3671C＞A引起MYO7A蛋白的MyTH4结构域改变，推测突变引起的氨基酸内增加的氢键和可能的碰撞，疏水性和极性改变而致蛋白的功能发生改变。
　　结论:此常染色体隐性遗传非综合征型耳聋家系的可能致聋病因为MYO7A基因的一个新的复合杂合突变，即c.3671C＞A(p.A1224D)和c.390_391insC(p.P81PfsX9)，且此新的复合杂合突变与DFNB2的表型相关。

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