核孤儿受体TR3在消化道肿瘤血管生成中的分子机制研究

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本文主要从以下几部分进行阐述：
　　第一部分 VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用
　　研究目的：
　　1、明确TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在及其结构差别;
　　2、检测VEGF-A和组胺对TR3三种转录变异体表达的影响;
　　3、检测其他炎性因子如TNF-a，PMA，LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响。
　　研究方法：
　　1、在Genebank数据库进行检索查找TR3基因编码的3种转录变异体信息，比对其内含子外显子区别，并设计特异性的实时定量PCR引物序列;用实时定量PCR和免疫印迹技术确认TR3三种转录变异体的存在和差异性的表达;
　　2、实验根据情况采用非对称t检验，和Mann-Whitney检验来进行统计学显著性的检查。p＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、TR3三种转录变异体的Genebank数据库信息及结构和实时定量PCR引物序列
　　TR3基因位于第12对染色体上，Genebank数据库收录的mRNA转录变异体有3个，分别为TR3转录变异体1、TR3转录变异体2和TR3转录变异体3。TR3-TV1由外显子3-10构成，缺失外显子1和外显子2，TR3-TV2则由外显子3和外显子5-10构成，缺失外显子1，2和4;而TR3-TV3则由外显子1，2以及外显子5-10构成，缺失外显子3和4。TR3-TV1和TR3-TV2均编码相同的59.8KDa大小的TR3-异构体1蛋白;而TR3-TV3的产物为61.2KDa大小的TR3-异构体2蛋白，该蛋白比TR3-异构体1蛋白多了13个氨基酸。
　　2、TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在和差异性的表达
　　这三种TR3转录变异体在细胞内的表达水平不同，在HUVEC和HDMVEC中都是TR3-TV1表达最低，而TR3-TV3的表达最高。我们进一步对VEGF-A刺激下三种TR3转录变异体的表达情况进行了研究。数据显示，在内皮细胞中存在TR3转录变异体，且这些TR3转录变异体在VEGF-A/Histamine的刺激下表达上调程度有所差异。
　　3、其他炎性因子如TNF-a，PMA，LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响
　　对HUVEC细胞，人结肠肿瘤细胞HCT116、人前列腺癌肿瘤细胞PC3和LnCap用生长因子EGF或炎性因子TNF-a，PMA，LPS和CHX进行刺激，发现，TR3的这三种转录变异体广泛存在于这些细胞内，并且在受到不同的炎性因子和生长因子刺激时，表达可以有不同程度的上调。
　　结论：
　　1、TR3存在三种转录变异体，且这三种转录变异体的表达存在差异性;
　　2、VEGF-A和组胺对TR3转录变异体的表达有很强的刺激作用，且均以TR3-TV2表达上调最为明显;
　　3、TR3三种转录变异体也存在于其他肿瘤细胞系中，且不同的炎性因子和生长因子对其表达的影响不同。
　　第二部分 VEGF-A和组胺对TR3/Nur77表达诱导作用的分子机制
　　研究目的：
　　1、检测参与介导VEGF-A和组胺对TR3转录变异体转录影响的可能信号通路。
　　2、检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响，并确定参与VEGF-A诱导TR3转录上调的VEGF受体类型。
　　3、检测IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。
　　4、检测介导组胺诱导的TR3转录上调的受体类型以及IGF-1R对组胺诱导的TR3转录上调的影响。
　　研究方法：
　　1、实时定量PCR方法检测多条常见信号通路抑制剂和shRNA对VEGF-A和组胺诱导TR3转录变异体转录的影响。
　　2、实时定量PCR方法检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响，并用免疫印迹方法检测VEGF下游MAPK表达情况。
　　3、用VEGF和EGF受体嵌合体系统对参与VEGF诱导TR3转录上调的VEGF受体类型继续确认，并检测其下游MAPK的表达。
　　4、加入IGF-1R特异性抑制剂和shRNA后，观察IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。用免疫印迹方法检测VEGF对IGF-1R磷酸化的影响，并用免疫共沉淀方法检测KDR与IGF-1R的相互作用。用特异性组胺受体抑制剂研究介导组胺诱导TR3转录避变异体的受体类型，并探讨IGF-1R对该通路的影响。
　　结果：
　　1、参与调节VEGF-A诱导TR3转录变异体表达的信号通路
　　发现:BAPTA/AM和环孢菌素-A几乎能完全阻断VEGF-A对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用。而且，PLC抑制剂U-73122，PLC显性失活对照，PKC抑制剂GF109203X，经PMA处理的PKC表达下调，PKCδ显性失活突变体，PKD抑制剂，PKD异构体1shRNA，和MEK抑制剂(PD98059)，IκB shRNA，p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂Ⅱ都几乎能完全抑制VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调。这些数据表明，Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路，NF-κB通路以及MAP激酶通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用，而PI3K-Akt通路则没有参与该过程的调节用。
　　2、参与调节组胺诱导TR3转录变异体表达的信号通路
　　对组胺诱导TR3转录变异体表达调节的信号通路研究发现:Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路，以及MAP激酶（ERK）通路在组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用，而PI3K-Akt通路和NF-κB通路则没有参与该过程的调节用。
　　3、VEGF家族其他成员对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用
　　VEGF-A与VEGFR1/Flt-1，VEGFR2/KDR，神经毡蛋白1(NP-1)以及神经毡蛋白2（NP-2）都能结合，VEGF-B和P1GF仅能与VEGFR1/Flt-1，NP-1和NP-2发生相互作用，而VEGF-E则仅能够与VEGFR2/KDR发生相互作用。数据表明，VEGFR2/KDR，而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。
　　4、VEGF嵌合受体无法导致TR3-TV2的高表达
　　所得的数据显示:与对照组相比相比，经转染EGDR的HUVEC细胞中，EGF仅能诱导TR3-TV2mRNA表达上调15倍作用，比VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染细胞低75％，而EGF诱导的TR3-TV3为5倍左右，与VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染HUVEC细胞类似。同时，研究表明除了VEGFR2/KDR外，应该还有其他受体参与了VEGF-A诱导的TR3-TV2高表达。
　　5、IGF-1R对VEGF-A刺激下的TR3-TV2表达的影响
　　对HUVEC细胞予以VEGFR2/KDR激酶抑制剂SU1498，IGF-1R激酶抑制剂AG1024处理后，或者进行转染shKDR或者shIGF-1R2后，予以VEGF-A刺激，实时定量PCR数据显示，AG1024和shIGF-1R2能显著性抑制TR3-TV2的表达上调，而shKDR几乎能同时完全抑制VEGF-A所诱导的TR3-TV2和TR3-TV3两种变异体的表达。综合所有这些数据，发现VEGFR2/KDR介导了VEGF-A所诱导的TR3-TV3表达，而VEGFR2/KDR或者EGDR仅能介导VEGF-A所诱导的低水平的TR3-TV2表达，高水平的TR3-TV2表达则需要另一种受体-IGF-1R的共同参与。
　　6、VEGF-A所诱导的IGF-1R磷酸化以及其与VEGFR2/KDR的交联作用
　　进一步对IGF-1R调节VEGF-A诱导TR3变异体表达的信号通路进行了研究。数据表明， VEGF-A能够诱导VEGFR2/KDR和IGF-1Rα/IGF-1Rβ的物理学相互作用。
　　7、参与组胺诱导的TR3转录变异体表达的受体类型及IGF-1R对该过程的影响
　　对经血清饥饿处理的HUVEC细胞分别用H1，H2和H4特异性的阻断剂处理后，发现TR3-TV2的转录刺激主要由H1受体介导，而TR3-TV3的转录上调则由H1和H4共同介导。结果表明，组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导，并且受体IGF1-R似乎也对这一通路有一定影响，但具体机制尚不明确。
　　结论：
　　1、钙PLC-PKC-PKD1通路和NF-κB通路和MAP激酶（ERK，p38和JNK）通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达中都起到重要作用;而组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达则主要由钙PLC-PKC-PKD1通路介导。
　　2、VEGFR2/KDR，而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。
　　3、VEGF-A和VEGF-E可以诱导胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的磷酸化，并促成其与VEGF受体2(KDR)发生交联，进而导致TR3-TV2的高表达。
　　4、组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导，并且受体IGF-1R对这一通路的传导有一定影响。

著录项

作者
赵圣强;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科内科学（消化系病）
授予学位博士
导师姓名秦成勇;
年度 2015
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正文语种中文
中图分类消化系肿瘤;
关键词
消化道肿瘤; 血管生成; 核孤儿受体; 分子机制;

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