不同类型的能量代谢抑制对人类精子活动力及其功能的影响

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随着人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)的广泛开展与应用，精子质量对受精结局的重要性越来越受到关注。维持长期且持续的运动状态是人类精子的重要特征。近年来各个国家及地区对精子质量的统计分析发现精子质量呈下降趋势，国际卫生组织(WHO)对精子质量的评判标准也在不断降低，因此提高精子质量，维持精子活动力和功能的完整性就显得尤为重要。精子的能量来源主要包括氧化磷酸化与糖酵解这两条通路，但究竟是哪条能量代谢通路占主导作用一直备受争议。糖酵解的低效率产能与低氧化损伤相矛盾，氧化磷酸化的高效率产能与高氧化损伤亦相矛盾；精子尾部能否获得由精子中段的线粒体进行氧化呼吸产生的能量；精子细胞内为什么会有大量的糖酵解关键酶以及精浆中大量糖类的存在等等这些都是众多争议的关键点。本研究结合目前的研究现状与理论基础，采用FCCP作为氧化磷酸化的抑制剂、DOG为糖酵解抑制剂，在不同处理时间点测定FCCP和DOG分别以及同时作用对人类精子活动力及其功能的影响。以正常精子样本和以上游法获得活力精子样本为研究对象，实验方法主要包括：CASA测定精子活力(a+b级，Motility)、快速前向运动(a级，Progressive)和曲线运动速度(VCL)；SYBR-14/PI双染法结合流式细胞仪检测质膜完整性；多功能酶标仪测定ATP含量；JC-1染色法结合流式细胞仪检测线粒体膜电位；DCFH-DA/PI双染法结合流式细胞仪检测H2O2水平；DHE/Yo-Pro-1双染法结合流式细胞仪检测精子细胞内O2·-水平。不同浓度的FCCP(1、5、10、50、100μM)对混合上游精子样本进行处理，每隔30min用CASA测定一次，结果发现FCCP对精子动力及功能的影响存在浓度依赖性：高浓度的FCCP(10、50、100μM)对精子动力(活力、快速前向运动、曲线运动速度)产生显著性的抑制作用(P<0.05)；1μM FCCP对精子动力的抑制作用不明显(P>0.05)；5μM FCCP对精子动力的抑制作用表现为仅在30-60min内抑制作用显著(P<0.05)，其他时间段抑制作用不明显(P<0.05)。质膜完整性的结果为仅50、100μM FCCP处理后的精子其质膜完整程度与对照组相比有显著差异(P<0.05)，说明对精子已产生毒性作用，破坏了质膜结构进而影响精子功能。线粒体膜电位随着FCCP浓度的增加逐渐降低，各浓度均与对照组有显著差异(P<0.05)。ATP含量也随着FCCP浓度(1μM除外)的增加而出现显著下降(P<0.05)，且5μM组在60min时ATP含量与对照组相比存在显著下降(P<0.05)，但在90min时ATP含量与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。O2·-和H2O2随着FCCP浓度(1μM除外)的升高，其水平都显著升高(P<0.05)。无糖BWW培养基与DOG-BWW培养基对精子动力产生显著性的影响(P<0.05)是在处理60min之后表现出来的。60min测定的质膜完整性结果为无糖组和DOG组与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)，提示处理组(无糖组与DOG组)在60min之前对精子的抑制作用不明显。无糖组和DOG组与对照组相比，线粒体膜电位无明显差异，印证了DOG对氧化磷酸化不产生抑制。60min、90min测定的ATP含量在处理组与对照组之间均出现显著性的差异(P<0.05)；另一方面60min测定的处理组的ATP含量在10～15nmol/108sperm，不足以完全抑制精子功能，而90min时DOG组的ATP含量小于10nmol/108sperm，低于正常精子的平均能量水平，严重影响精子功能。DOG组的O2·-和H2O2略高于对照组，但没有显著性差异(P>0.05)。与分别加入DOG或FCCP的处理组相比，5μM FCCP和DOG同时加入后，在90min之内便将精子运动几乎完全抑制，处理后观察到的多为不动或者原地颤动的精子，精子动力产生显著抑制(P<0.05)；ATP含量亦显著性下降(P<0.05)；O2·-水平显著性升高(P<0.05)。另一方面，DOG组在60min时其精子动力与ATP含量均显著性高于FCCP处理组，90min时却又显著性低于FCCP组。O2·-水平在DOG组与FCCP组之间没有显著性差异。本研究的结论为氧化磷酸化通路主要在人类精子运动前期起主导作用，极易受FCCP的抑制而降低精子动力及功能，后期精子主要利用糖酵解进行供能，其目的是为了减少氧化损伤从而来维持长期快速前向运动。糖酵解和线粒体的氧化呼吸都参与ATP的合成，它们互相依赖，从而使精子在应对体外不同能量代谢底物刺激时能灵活转变，从而提供充足的能量以维持精子活动力和功能。

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作者
胡珍;
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作者单位

温州医科大学;

温州医学院;

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授予单位温州医科大学;温州医学院;
学科中药学
授予学位硕士
导师姓名黄长江;
年度 2012
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类神经病学与精神病学;心脏、血管（循环系）疾病;
关键词
不同类型; 能量; 代谢抑制; 人类; 精子活动力; 功能;

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