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计算分析疱疹病毒感染引起宿主基因转录组和表观遗传组的改变

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摘要

第一章 引言

1 HSV-1介绍

1.1 HSV-1危害

1.2 HSV-1目前研究进展

1.3 本课题研究目标

1.4 本课题科学价值和临床应用价值

2 RNA-sequencing

2.1 RNA-sequencing测序技术方法

2.2 RNA-sequencing优势与难点

2.3 RNA-sequenc数据分析一般方法

3 ChIP-sequencing

3.1 ChIP-sequencing测序技术方法

3.2 ChIP-sequencing优势与难点

3.3 ChIP-sequenc数据分析一般方法

4 CTCF

4.1 CTCF介绍

4.2 CTCF生物功能

第二章 HSV-1诱导基因差异表达,可变剪接,可变加尾和异构体表达

1 课题的设计

2 RNA-seq技术路线

3 材料与方法

3.1 主要仪器

3.2 试剂与耗材

3.3 主要溶液及其配置

3.4 细胞与病毒

3.5 RNA-seq测序样品准备

3.6 RNA-seq数据分析

3.7 实时荧光定量PCR和实时定量PCR

4 实验结果

4.1 HSV-1感染宿主细胞BJ诱导基因差异表达

4.2 HSV-1感染BJ细胞导致可变剪接

4.3 HSV-1感染BJ细胞导致可变加尾

4.4 HSV-1感染BJ细胞Isoform表达

4.5 差异表达,可变剪接,可变加尾和异构体的GO terms变化产生不同的调控机制

5 结论

第三章 HSV-1改变CTCF和RNA PolⅡ结合

1 课题的设计

2 ChIP-seq技术路线

3 材料与方法

3.1 主要仪器

3.2 试剂

3.3 主要溶液及其配置

3.4 ChIP-seq测序样品准备

3.5 ChIP-seq数据分析

4 实验结果

4.1 CTCF结合变化

4.2 CTCF与基因表达之间的关系

4.3 HSV-1感染前后RNA polⅡ与RNA-seq关系

5 结论

参考文献

附录 缩略词表

致谢

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摘要

Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus typeⅠ,HSV-1)是一种双链线性DNA病毒,基因组全长152kb,可以编码80个蛋白基因,超过80%的人被HSV-1感染。HSV-1从外周神经节感觉神经元进入潜伏期感染。应急信号可以引起HSV-1在感觉神经元重激活,裂解感染确保表皮细胞神经元活化,最终造成唇疱疹脑膜炎,甚至导致死亡。HSV-1裂解期感染是快速展开,即早期基因(immediate early, IE)的表达,包括ICP0和ICP4,这些基因的表达可以立即招募宿主的RNA聚合酶和其他的转录调控因子,从而促使HSV-1病毒的早期基因的表达,准备开始病毒DNA的合成和晚期基因的表达,而晚期基因是在病毒感染6小时后才开始表达的。在以上所提及的生物过程中,病毒可以利用宿主的调控因子,宿主的反应和途径来促进病毒的复制。宿主细胞遭到病毒的入侵后,可以引起许多宿主反应,比如激活干扰素途径,DNA损伤反应,凋亡和其他的抑制病毒增长的机制。而病毒基因自身编码的蛋白因子可以抵抗以上所说的宿主反应,从而确保病毒可以顺利地转录,基因组合成和组装。比如ICP34.5是干扰INF-β途径的关键性的病毒因子;ICP27和ICP22是宿主凋亡反应的调控因子,通过失活ATR激酶来抑制DNA损伤反应;ICP0通过在DNA损伤反应中替换宿主沉默复合物CoREST以及降解RNF8和RNF168,从而抑制宿主转录沉默活性;HSV-1也编码ICP27来抑制RNA可变剪接和VHS降解宿主RNAs。尽管已经有这些研究进展,但是病毒与宿主之间的表观遗传相互作用依然不是完全了解。
  HSV-1在人类表皮细胞进行裂解期感染并且剧烈的改变宿主细胞核。以前的DNA芯片分析感染的小鼠角膜和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),揭示广泛的宿主基因表达谱的改变。在这里我们通过高通量测序RNA-seq,分析了HSV-1感染人类表皮纤维BJ细胞的RNA-seq,发现差异基因表达,可变剪接,可变加尾和基因变体变化。与对照组相比,HSV-1感染后引起978个上调基因和61个下调基因,同时造成217个可变剪接,161个可变加尾和1827个基因异构体。结果表明,我们发现超过700个基因的基因异构体发生变化。有意思的是,GO分析揭示,参与神经元生成的基因在病毒感染后显著上调,而在可变剪接,可变加尾和基因异构体方面没有任何变化,表明可能是由于ICP0的去抑制,造成神经元基因显著上调。我们找到了许多病毒与宿主相互作用的重要基因,比如转录调控因子brd2和cbx4。我们还发现了108个基因参与RNA代谢,包括选择性降解ARE元件细胞因子zfp36。分析结果揭示了许多新的参与病毒与宿主相互作用的基因,并且暗示可变剪接和可变加尾作为重要的机制,在病毒感染的细胞中产生新的调控功能。
  有趣的是,病毒感染引起宿主染色质急剧动态重组,比如在全基因组中,将近90%的CTCF在病毒感染后缺失。高度诱导的基因倾向与CTCF相互作用,表明CTCF可能在高度调控的基因发挥重要的作用。RNA-seq和RNA PolⅡChIP-seq相比较,我们发现130个基因在转录水平被诱导,而444个是在RNA代谢水平被调控。
  总之,通过结合RNA-seq,ChIP-seq,经典的病毒学和基因组学研究,我们能够揭示HSV-1感染人类表皮细胞后转录组和表观遗传组的重大变化。这些分析给细胞基因组如何应对急性外部感染,比如裂解期病毒感染,和在基因组水平展开的病毒与宿主之间的表观遗传作用新的启示。

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