通过检测感染后宿主的差别性基因表达进行微阵列介导的疱疹病毒感染诊断

                          发明领域

本发明总体上涉及诊断、检测宿主应答，监测、治疗与处理哺乳动物中疱疹病毒感染的方法与系统。本发明可实际应用于早期诊断感染、检测对疱疹病毒感染的特异性免疫应答(具有或不具有临床症状)，能对受临床和亚临床影响的哺乳动物作出更好的治疗和处理决定。本发明也可实际应用于监测有发生疱疹相关后遗症风险或因潜伏病毒引起的临床体征复发的哺乳动物。这种哺乳动物包括但不限于：因患其它疾病或给予治疗药物所致、患有慢性疲劳综合征、遭应激或运动训练而免疫减弱的动物。

                          发明背景

疱疹病毒代表了广泛导致人与家养和野生动物各种疾病的一个病毒大家族。已知的疱疹病毒类型超过80种，但只有8种已知能引起人类致病。这8种分为下表所示的三个亚科。

疱疹病毒感染分布广泛，导致的疾病具有严重经济重要性。事实上，大多数种类的哺乳动物在生命的早期曾受到疱疹病毒的至少一种毒株感染。感染是持久性的，并且没有已知的治疗方法。可使用抗病毒药物来治疗，但往往是在症状发生后应用和/或服用(当它们至少有用时)，由于副作用和费用而不能用作预防给药。因此，它们的应用一般限于人类。

目前基于抗体检测的诊断方法只能检测临床体征出现后与患者从其它动物感染后产生的抗体。其它检测方法包括聚合酶链式反应扩增病毒转录物或病毒DNA，组织培养分离病毒和/或病毒中和试验。

所有疱疹病毒感染是持久的。初始感染后，病毒进入潜伏期。当患者免疫力减弱或受应激或强烈运动训练时，疾病可重新激活。病毒的重新激活可导致症状复发，或全身不适，或对锻炼的耐受性或表现降低，或者可以无症状。

病毒抗体、抗原或转录物的测定(值)不一定与疾病或临床体征相关联。

可用的有效疫苗几乎没有。

可用药物来治疗，但它们昂贵，为获得最大疗效需要在主要临床体征出现前给予。

流行病学与临床表现

疱疹病毒在正常与免疫力减弱的宿主中可导致几种临床表现。大多数疱疹病毒感染时无症状，疱疹传播的大多数病例是爆发时尚未意识到或依旧未诊断出的人。

50-90％的成人具有对HHV-1或1型人单纯疱疹病毒(HSV-1)的抗体；20-30％成人具有对HHV-2或2型人单纯疱疹病毒(HSV-2)的抗体。(病毒)在社会经济地位较低群体与性滥交个体中传播更普遍。HSV-1通常与口面部(orofacial)区域初始感染有关，潜伏感染三叉神经节，而HSV-2通常与生殖器感染有关，潜伏感染骶骨神经节。虽然初始与复发感染通常是自我限制的(self-limited)，但HSV能导致严重疾病，例如新生儿播散性疱疹，病毒性脑炎与致盲性角膜炎(blinding keratitis)。

在急性初始感染期间，HSV持久潜伏在与进入的皮肤或粘膜部位相对应的神经根节(nerve root ganglia)中。在口唇(orolabial)感染中，HSV潜伏在三叉神经节中，而在生殖器或肛门直肠感染时潜伏在骶骨神经节中。各种刺激，例如紫外光与感觉神经损伤可重新激活潜伏的HSV。复发性病损发生在或接近初始感染部位。复发似乎与某些方式降低个体对疾病抵抗力的因素有关，例如感冒或上呼吸道感染，高强度体力运动，日晒，应激，妇女月经与一些个体因食物而触发，特别是大量巧克力或花生。

在重激活期间，HSV在神经节内复制，后代病毒颗粒沿感觉神经向外周转移至其重激活神经节支配的粘膜或上皮表面。然后病毒在皮肤表面活跃复制产生了HSV感染复发的典型临床体征与病损(如同受HSV感染的人复发感冒的情况一样)。

“EB病毒”(EBV)或HHV-4与也称为“腺热”的传染性单核细胞增多以及肿瘤形成(例如，伯基特淋巴瘤与鼻咽癌(nasopharyngeocarcinoma))有关。此外，在免疫抑制与患何杰金病的患者中发现有EBV。EBV在全世界都有，大多数人在其一生中曾受其感染。在美国，多达95％的成人在35-40岁时受感染。一旦母体抗体保护作用(出生时存在)消失，婴儿即对EBV易感。

传染性单核细胞增多的EBV症状包括发热、咽喉痛、淋巴腺肿胀。有时可发生脾脏或肝脏肿胀。很少发生心脏问题或涉及中枢神经系统，传染性单核细胞增多几乎从不致命。与患传染性单核细胞增多的人接触的大多数个体以前受过EBV感染，不会有患传染性单核细胞增多的风险。此外，EBV传播需要与受感染者的唾液(在口中发现病毒)密切接触。此病毒一般不通过空气或血液传播。潜伏时期，或从感染到症状出现的时间为4-6周。传染性单核细胞增多患者能在数周内中将此感染性疾病传播给他人。然而，不推荐专门的预防措施或隔离方法，因为在健康人的唾液中也经常能发现此病毒。事实上，许多健康者可终身携带并间歇传播此病毒。这些人通常是人与人传播的主要来源(primary reservoir)。有鉴于此，几乎不可能防止该病毒传播。

虽然传染性单核细胞增多的症状通常会在1或2个月中消退，EB病毒在此人一生的其余时间可维持休眠或潜伏在咽喉与血液的少数细胞中。该病毒可以周期性地重新激活，常见于受感染者的唾液中。此重激活发生时往往没有明显疾病症状，但可以有非特异性症状，例如不适或运动表现不佳。EBV也能在机体免疫系统的一些细胞中建立终身的休眠感染。此病毒极少的携带者后来可出现伯基特淋巴瘤与鼻咽癌，两种在美国不常发现的罕见癌症。EBV似乎在这些恶性肿瘤发生中起着重要作用，但可能不是这些疾病的唯一原因。

巨细胞病毒(CMV)或HHV-5普遍见于所有地理区域与社会经济群体中，在美国，50％-85％的40岁成人受感染。CMV可导致免疫抑制者肺部感染。此外，据信CMV与EBV与慢性疲劳综合征有关，每100,000人中有6人受该病影响。任何以前感染者的体液中可排出感染性CMV，因而可在尿、唾液、血液、眼泪、精液与母乳中发现。病毒的排出可间歇发生，而没有可检测的体征，也不导致症状。CMC在人与人之间传播。CMV可经性传播，也可经母乳、移植的器官传播，很少经输血传播。虽然该病毒不是高度传染性的，但其显示能在家庭内与年轻儿童中传播。常能阻止该病毒的传播，因为它最常见的传播方式是通过受感染体液与手接触，然后该病毒被易感者的鼻或口吸收。因此，当处理儿童的物品如尿布时应当心。用肥皂与水简单洗手能有效地将该病毒从手上除去。

CMV引起的症状少于EBV，往往发生长期不明显的感染，在此期间病毒寄居在细胞中而不导致可检测的损伤或临床疾病。因服药或疾病导致机体免疫系统严重受损时常使该病毒从潜伏或休眠状态重新激活。CMV感染在婴儿与幼儿中常见但没有症状；因此，将已知受感染的儿童停学或停学不合理也不必要。类似地，住院患者不需要单独或精心的隔离预防措施。对儿童或患者进行CMV筛检的价值可疑。该方法的成本与操作不切实际。不应将已知感染了CMV的儿童单独排除、隔离或特别对待。反而，建议对照料儿童的人员给予教育与建立有效的卫生措施。CMV可能导致问题的情况是妊娠，婴儿和儿童护理工作的人与免疫力减弱的人。

水痘-带状疱疹病毒(VZV)或HHV-3通常导致儿童水痘，其(感染)需要吸入感染者鼻部或咽喉排放入空气的含病毒颗粒的小液滴。该病毒通过感染呼吸道的细胞进入人体，从而扩散至身体的大多数其它部位，包括皮肤而导致特征性皮疹。各病损(斑点)在约一周内经历了一系列特征性阶段。丘疹和小泡发展为脓疱，然后结痂，愈合。水痘的显著特征是长出几个连串的斑点，达到疾病的高峰期(首次出现皮疹的3-4天后)，从新的水泡发展为结痂的所有阶段均有病损。

VZV以此方式传播的能力显示水痘极具传染性。病毒从气道排出始于潜伏后期，持续至所有斑点结痂。虽然皮肤水泡含有病毒颗粒，但它们不是主要传染源。疤无传染性。由来已久的干预方法是尽可能降低发热与不适(即，退热药物、冷水浴和安慰性洗液(soothing lotion))。

水痘是VZV初始感染的临床表现。从初始感染恢复后，VZV并不从体内消失，而是在脊髓中感觉神经的根部处于休眠状态(通常可数十年)。当感染重新激活后，引起受感染感觉神经所分布区域疼痛与皮疹。潜伏感染可导致带状疱疹发作。这通常在老年人中发生，可能是因为随着年龄增长，免疫系统不能控制该病毒。带状疱疹的皮疹含有VZV颗粒，像水痘的皮疹一样。因此，带状疱疹将水痘传染给以前未患水痘的人的风险不大。婴儿通常可通过与患带状疱疹的祖父母亲密接触而染上水痘，但这种传播风险低，因为带状疱疹期间VZV不通过喉部排出。

玫瑰疹病毒或HHV-6与儿童和免疫力减弱患者的“玫瑰疹”和“婴儿疹(infantum)”感染有关。例如，AIDS患者显示有HHV-6感染，虽然HHV-6感染的意义尚不清楚。HHV-6对抗病毒药物敏感。然而，抗病毒药物如何抵御HHV-6或该病毒对这种药物的抗性如何产生尚不清楚。HHV-6的有意义方面是其推测其分别与多发性硬化症和慢性疲劳综合征有关。

对HHV-7与HHV-8(细长病毒)了解更少。HHV-7直接参与任何人类疾病的明确证据还未见报导。然而，研究显示HHV-7可能与HHV-6相关感染有关。一有关观点是，据信HHV-8感染与卡波西肉瘤有关。

此外，认为疱疹病毒是养马业损耗的重要原因与严重损害马的运动能力的原因。兽医、训马员与马主人倾向于只凭经验治疗患呼吸道疾病的马，因为缺乏临床指南和实验室方法，也因为不了解病毒和继发性细菌感染与疾病持续时间之间的关系。其它诊断或评估方法往往是复杂、侵入性、不方便、昂贵、耗时、动物可能因该方法而受伤的危险并且往往需要将动物转运至诊断中心。

在西澳大利亚进行的研究中，从48％具有呼吸道问题或(运动)表现不佳的马的血液中分离到疱疹病毒。然而，也可从54％不具有临床体征的马中分离到疱疹病毒，从而得出结论：血细胞中存在该病毒不是疾病的决定因素。从鼻部拭子中分离病毒更能表明呼吸道感染，但只在50％的临床病例中分离到。据报导在英国多达75％的马携带有该病毒。

马鼻肺炎与马流产公认由两种不同但抗原性相关的病毒(称为4型马疱疹病毒(EHV-4)与1型马疱疹病毒(EHV-1))导致的马疾病。EHV-1是马流行性流产、产期死亡、呼吸道疾病与神经体征(偶尔)的病因。流产是EHV感染的最惊人与可怕的结果，它是饲养者的经济灾难，造成客户流失与大量的保险赔付。EHV-1或极其相关的EHV-4造成的呼吸道疾病可不良地影响马的竞技表现。

在澳大利亚的Hunter Valley进行的研究显示养马业中EHV-1感染流行，该地方60日龄前幼驹常受EHV-1感染。在美国进行的独立研究显示85％的幼驹在断奶后6-8个月血清阳转。据信，幼驹是通过与母马或同群幼驹的呼吸道液滴接触而感染。

EHV-1是一种偏爱呼吸道上皮细胞的DNAα疱疹病毒。该病毒通过免疫系统细胞在全身传播至其它器官。因为此两种病毒在抗原性上相关，目前无法通过血清学检验(血液检验)来确定马是否受EHV-4或EHV-1中一种或两种的感染。例如，如果作为幼驹的马受EHV-4感染，其血清中产生的抗体不仅能与EHV-4也能与EHV-1反应，因此，无法知道这种幼驹是否只受EHV-4感染。EHV-4只证实可导致呼吸道疾病，而EHV-1还能导致神经与生殖疾病(Wilcox和Raidal，2000，“病毒在呼吸道疾病中的作用”(Role of viruses inrespiratory disease)，RIRDC出版号00/146，RIRDC项目号UMU-22A；Dunowska等，2002，New Zealand Veterinary Journal 50(4)：132-139；Dunowska等，2002，New Zealand Veterinary Journal 50(4)：140-147)。

已证明EHV-1是持久、终身潜伏性感染，其重新激活导致马呼吸道疾病再次发作。然而，当与第一匹马(索引病例(index case))接触而感染的其它马匹是牧场中的妊娠母马时，该病毒重新激活并将其传播给其它与之接触的妊娠母马，其后果对饲养农场更严重。索引病例母马自己可能流产或导致一匹或多匹与之接触的母马流产。流产的胎儿、胎膜和液体受到EHV-1严重感染，污染了发生流产的场所。该牧场中天生好奇的其它母马来到流产场所，嗅该胎儿与肽膜。这样，该牧场中几乎100％的母马受到感染，在10或20天内流产，从而导致通常称为的“流产风暴”。EHV-1流产的这种爆发对全球养马业，特别是纯种马(Thoroughbred)和标准马(Standardbred)极具经济重要性。

免疫力与诊断

疱疹病毒能诱导强的体液抗体反应，虽然此反应保护宿主的有效性值得怀疑。最终是通过细胞介导的机理，例如细胞毒性淋巴细胞或天然杀伤细胞赋予保护作用。疱疹病毒感染的关键特征之一是终身持久感染与潜伏。该病毒维持在细胞核中，在临床症状消退后很久仍可从许多器官分离到。因此，当患者(马)具有难以名状的临床体征，例如(运动)表现不佳或不适，可从组织分离到病毒，但是病毒的激活是否是这些症状的原因尚不清楚。应激或其它因素可导致休眠病毒激活与伴随的临床体征(Walker等，1999，Veterinary Microbiology，68：3-13)。

HSV-1或HSV-2感染能诱导细胞介导的免疫力，产生常规类型与特定类型的抗体。虽然这些免疫机理看来不影响HSV潜伏的发生或复发频率，但是一旦发生(病毒)重新激活，它们可调节临床复发的严重性并减少HSV复制。

HSV-1或HSV-2感染引发的宿主免疫反应显示提供了抵御随后HSV感染的部分保护作用，因为在HSV感染的个体中常见对自体感染的抵抗力。此外，与以前未感染过HSV的人相比，当感染过HSV的患者受另一HSV类型感染时，临床体征常更缓和。

在诊断实验室中HSV是最频繁检测到的病毒。可通过病毒分离、聚合酶链式反应(PCR)(Espy等，2000，J Clin Microbiol.，38(2)：795-799)与组织病理学(方法)作出诊断。这些方法均不能用于控制与监测疾病。可用于诊断的其它实验室检验包括用显微镜检查专门处理的刮屑(scrapings)与血液抗体检验。一些检测只在早期有效，为证实疱疹存在可能需要多种这些检验。生殖器疱疹可能会误诊为其它疾病，包括梅毒。血清抗体水平高也是近期感染的指标。如果某人确实具有可见症状，推荐在症状出现后的前48小时内进行培养检验。48小时后，有得到假阴性检验结果的风险，因为症状可能开始痊愈并且皮肤上没有足够的病毒来培养。

当某人没有可见症状，但担心有疱疹感染时，可采用血液检验。血液检验实际上不是检测病毒；而是找寻抗体(机体的免疫反应)，但50-90％的人血液有阳性抗体。目前可用两次血液检验得到疱疹的精确结果。与任何血液检验一样，这些检验不能测定感染部位是口腔还是生殖道。然而，由于生殖器疱疹大多数病例是HSV-2造成，2型抗体结果阳性最可能表明是生殖器疱疹。就最精确的结果而言，推荐从与疱疹(病毒)可能的最后接触时间等到至少12-16周后有足够时间产生抗体。

根据发热、咽喉疼痛、淋巴腺肿胀症状与患者的年龄提出EBV与传染性单核细胞增多的临床诊断。通常需要实验室检验来确认。传染性单核细胞增多患者的血清学结果包括白细胞计数升高、某些非典型白细胞百分比升高与“单斑点”检验呈阳性反应。

通过酶联免疫吸附测定(或ELISA)，一种检测抗体的血清学检验进行CMV临床诊断。可利用其结果确定婴儿是否有急性感染、以前感染或被动获得的母体抗体。其它检验包括各种荧光试验、间接血细胞凝集试验与乳汁凝集试验。

根据呼吸道症状，即咳嗽或鼻涕进行EHV诊断。然而，区分呼吸道细菌性感染或病毒性感染、锻炼诱导的肺部出血与过敏至关重要。误诊的代价很大。马主儿诊断病症的成本包括运输、兽医费用和病理检验。呼吸道疾病可快速杀死(马匹)、产生终身残疾、阻碍(运动)表现或需要长期休息。处于活性病毒携带状况的马匹可再感染其它动物。

以养马业为例，需要对马匹是否存在EHV-4和/或EHV-1抗体进行精确、类型特异的血清学监测来帮助我们了解这些病毒，特别是EHV-1的流行病学(特点)。EHV-1感染难以诊断和治疗，该行业欢迎如何治疗患病马匹的任何有用信息。然而，目前不能区分多克隆血清中的EHV-1或EHV-4抗体，因为该两种病毒之间有广泛的抗原性交叉反应。采用这种特异性血清学检验对控制(或许根除)EHV-1与选择疫苗接种的候选马匹也具有深远意义。虽然感染后马匹受到短时期保护抵抗EHV-1，但通常没有足够高水平的长期免疫力来始终如一地抵御EHV-1疾病。因此，马匹在其一生中可反复感染数次，而疱疹病毒能在宿主动物中建立终身潜伏感染使疫苗接种方案复杂化。

尚没有能预防HSV疾病发生的疫苗。虽然以HSV-2包膜糖蛋白为基础的几种蛋白质亚单位疫苗已进而后期临床试验。选择这些抗原是因为它们是中和抗体反应的靶标并能引发细胞免疫力。

已开发了口服抗病毒药物，例如阿昔洛韦、泛昔洛韦(famcyclovir)或伐昔洛韦(valacyclovir)来有效治疗疱疹(病毒)感染。这些药物可用于治疗疱疹爆发或可用于抑制疱疹复发。较低的剂量有助于减少频繁爆发人群中疱疹发作的次数。更昔洛韦、喷昔洛韦(penciclovir)和阿昔洛韦是1型(HSV-1)和2型(HSV-2)单纯疱疹病毒的有效抑制剂。此抗病毒疗法昂贵，需要在最早临床体征发作时给予。这些抗病毒疗法是基于采用自杀基因，例如胸腺嘧啶激酶基因。比较了更昔洛韦、喷昔洛韦和阿昔洛韦诱导单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVTK)系统导致细胞死亡的效果(Shaw等，2001，Antivir Chem Chemother.，12(3)：175-86)。所有化合物延缓了HSVTK转化细胞的生长或降低了其存活。

除了治疗这些症状外，对EBV和传染性单核细胞增多没有专门的治疗方法。没有抗病毒药物或疫苗可用。一些内科医生开了5天类固醇疗程来控制咽喉与扁桃体肿胀。有报导说使用固醇能降低疾病的总时间和严重性，但这些报导未发表。最后，即使检测EBV抗体，例如早期抗原试验提示存在重激活感染时，此结果不一定表明患者目前的医学病症是EBV感染所致。许多没有症状的健康者在首次感染EBV后可多年具有EBV早期抗原的抗体。

目前，健康个体中存在的CMV感染不必治疗。现正在婴儿中评估抗病毒药物疗法。更昔洛韦用于治疗免疫抑制与患视觉相关或威胁生命疾病的患者。疫苗仍处于研究和开发阶段。

通常不用专门的抗病毒化合物治疗水痘，因为它持续时间短以及通常温和性质不复杂。一些医生相信抗病毒药物适合于疾病可能更严重的老年人。水痘疫苗(水痘病毒(varicella)疫苗)从1995年开始使用。研究显示水痘病毒疫苗预防疾病的有效性为85％。该疫苗有益于无免疫力的成年人，特别是处于高风险的成年人，例如儿童护理与保健人员。因为大多数成年人有免疫力，推荐在疫苗接种前检查血清学状态。

治疗带状疱疹的主要难点是快速缓解疼痛。四种因素独立地增加了持久疼痛的风险：年龄增长、皮疹出现时严重或中等严重的疼痛(称为急性疼痛)、皮疹出现前的疼痛(称为前驱疼痛)与皮疹出现3日内没能获得足够的抗病毒治疗。认为疼痛，特别是持久疼痛在很大程度上是病毒诱导的受感染神经损伤所致。应用抗病毒药物的原理很简单：通过尽可能快的停止病毒复制来尽可能减少神经损伤。带状疱疹对口服抗病毒药物，即阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦确有反应。

早期鉴定EHV-1感染，特别是病毒性流产对于治疗马匹至关重要，从而使易感马匹不会发生周期性反复感染与复发。由于造成训练天数丧失、反复感染和疾病复发、流产和(运动)表现不佳，EHV感染对养马业造成的代价很大。治疗主要依赖于精确诊断。可利用疫苗引发强体液免疫反应，但这些疫苗不具完全保护力。突发性感染(breakthrough infection)通常发生于疫苗接种动物。虽然可采用疫苗，但一般知道它们提供的保护作用寥寥无几，并且在疫苗接种动物中往往发生突发性感染。抗体治疗只能预防继发性细菌感染。

目前，诊断血液中的疱疹病毒以及相关疾病的方法是依据抗体-抗原定量测定或检测病毒遗传信息(例如，通过聚合酶链式反应)。例如，美国专利6,506,553描述了通过检测血液样品中的抗原抗体来诊断EBV以及相关疾病的试验。该试验检测血液中，更具体地说血清中EBV早期抗原的弥散性(EA-D)和限制性(EA-R)组分的IgG和IgM抗体。可采用此试验来诊断EBV-相关疾病，例如传染性单核细胞增多(IM)；也可用于区分该疾病的急性期和康复期的个体。然而，此专利描述的方法是检测早期抗原抗体，而不是检测病毒或对该病毒的免疫反应。

美国专利6,537,555描述了根据HSV抗原的检测(结果)来诊断和治疗HSV感染的组合物与方法。然而，此专利没有描述检测病毒或对该病毒的免疫反应的方法。

国际公布WO 99/45155描述的基因表达和分子诊断方法用于扩增和检测EBV核酸，特别是RNA特异性序列。此方法特别适用于检测循环外周血细胞中、人(肿瘤)组织样品及其薄切片中(利用“溶液中”扩增或“原位”扩增技术)、与可能含有EBV感染细胞的其它生物学样品中EBV基因表达的晚期感染。然而，此方法只检测病毒转录物，最适合于晚期疾病诊断。此方法也不检测对导致不适、发热与淋巴结肿胀等最早症状的病毒感染的免疫反应。

美国专利申请公布20040072147公开了利用探针寡核苷酸与至少两种引物寡核苷酸来选择性扩增以下特定类型疱疹病毒或毒株的靶区段包括：HSV-1、耐药性HSV-1、HSV-2、耐药性HSV-2、VZV、EBV(HHV-4a和HHV-4b)、CMV、淋巴潜隐病毒(HHV-6a、HHV-6b)、HHV-7和细长病毒(HHV-8)。然而，此方法不能提供疾病阶段或动物何时受感染或疾病是否为活动的任何信息。

美国专利6,193,983描述了检测EVH-4和EVH-1型特异性糖蛋白的方法用于临床上与这种糖蛋白的特征相关的领域。此方法检测抗EHV-1和EHV-4特异性抗体，但熟知大多数马匹在幼年与这些病毒接触过，抗体滴度可持续一定时间。所以，此方法不能提供疾病阶段或动物何时受感染或疾病是否为活动的任何信息。

总之，疱疹病毒的各种毒株感染是社区中普遍的现象，导致具有严重经济影响的疾病。大多数人和家养动物在幼年时都受到疱疹病毒的至少一种毒株的感染，且该感染是终身的。疱疹病毒进入潜伏期，可重新激活而导致症状复发。病毒的重激活常往往无症状，但可表现为不适或非特异性症状，例如低烧、嗜睡、慢性疲劳、运动耐力不佳或运动表现不佳。生理应激(例如，繁重的锻炼、并发的疾病、精神压力)，或免疫系统减弱(例如HIV感染、免疫抑制治疗)可导致疱疹病毒重激活而产生慢性感染症状。鉴于这些原因，监测疱疹病毒感染往往重要，特别是免疫力减弱的患者或杰出的运动员。目前的抗体诊断方法本身不监测疱疹病毒感染，因为这些方法检测的血清抗体在感染后7-14天才升高并因病毒潜伏而持续升高。目前的其它诊断方法，例如病毒分离和PCR本身不监测(病毒感染)，因为这些方法费力或者病毒基因组不是时刻存在于血液细胞中。目前诊断方法获得的结果不与临床体征发作的时间相关联。例如，首先在最初感染后10-14天可检测到抗体并可长期存在。单靠抗体检测不能表明感染发生的时间或者疾病活动水平，检测病毒转录物或病毒蛋白也不表明疾病活动水平。宿主的免疫系统最终负责抵抗病毒侵入的保护作用。是免疫反应，而不是病毒本身导致可该疾病的临床体征。更合适于疱疹病毒感染的监测方法是检测宿主对感染的特异性免疫反应。

同样，目前需要更有效的方法来诊断疱疹病毒感染，通过宿主免疫反应测定活动疱疹病毒感染与鉴定适合用抗病毒药物治疗性或预防疗法的动物。在所有病例中，初始感染导致潜伏感染，免疫力减弱的患者也往往有复发危险。在这种病例中，症状可能明显或不明显，可检测或可传播。因此，目前需要更好的方法与试剂来评估与监测处于疱疹病毒感染和/或复发危险中的哺乳动物。

                          发明简述

本发明公开了检测疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染的方法与系统。鉴定与描述了用于(检测)疱疹病毒感染的免疫系统细胞的一组预测性的基因。这些基因及其产物可用于基因表达试验、蛋白质表达试验、全细胞试验与设计和制备治疗剂。它们也可用于测定具有或不具有疾病临床体征的动物。有人提出，当这些试验频繁用作对病毒活动的反应指标时，可获得更好的应对决定与治疗方案，包括杰出运动员或免疫力减弱患者所用的方案。

本发明代表了目前处理受感染动物治疗技术的显著进步。在某些优选实施方案中，依赖于检测宿主细胞中某些标记，特别是循环白细胞的水平，而不是检测病毒产物或抗病毒抗体。同样，这些方法适用于广泛筛选有症状与无症状动物。在以循环白细胞为分析对象的某些实施方案中，可在检测血清疱疹病毒特异性抗体之前，宜在该病毒进展的非常早期阶段检测宿主对疱疹病毒感染，特别是EHV感染的反应。

因此，本发明通过检测宿主对疱疹病毒的反应来解决诊断疱疹病毒感染的问题。优选的实施方案包括监测免疫系统的外周白细胞中某些基因的表达，所述基因表达反映于存在疱疹病毒感染相关的RNA水平或蛋白质产生模式的改变。

因此，在一方面，本发明提供诊断测试对象，特别是马匹测试对象中存在疱疹病毒感染，特别是活动疱疹病毒感染的方法。这些方法一般包括检测该测试对象中至少一种选自以下的基因(本文也称为“疱疹病毒感染标记基因”或“HVI标记基因”)的异常表达：(a)一种基因，其多核苷酸表达产物含有与以下任一序列有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113(参见表1)，或其互补序列；(b)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114(参见表1)；(c)一种基因，其多核苷酸表达产物含有编码与以下任一序列的至少一部分有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)一种基因，其多核苷酸表达产物含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。本发明的这些HVI标记基因在疱疹病毒感染或患疱疹病毒感染相关病症的动物中表达异常，所述病症的示范性例子包括免疫抑制、应激、高强度的田径训练、并发感染与特发性病症。

本文将所用的HVI标记基因的多核苷酸表达产物称为“疱疹病毒感染标记多核苷酸”或“HVI标记多核苷酸”。本文将HVI标记基因的多肽表达称为“疱疹病毒感染标记”或“HVI标记多肽”。

因此，在一些实施方案中，所述方法包括检测选自以下的HVI标记多核苷酸的异常表达：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性核苷酸序列的多核苷酸：SEQ IDNO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少可在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它实施方案中，所述方法包括检测选自以下HVI标记多肽的异常表达：(i)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(ii)含有以下任一序列一部分的多肽：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基；(iii)所含氨基酸序列与以下任一序列的至少15个毗连氨基酸残基至少有30％相似性的多肽：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；和(iv)含有以下任一序列的一部分的多肽：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有该序列的至少5个毗连氨基酸残基，并且与能和(i)、(ii)或(iii)所述某序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用。

这种异常表达一般通过以下步骤检测：(1)检测得自测试对象的生物学样品中至少一种HVI标记基因表达产物的水平或功能活性，和(2)将所检测到的各表达产物的水平或功能活性与得自一位或多位正常对象或一位或多位未患此疾病(例如，无活动感染)的对象的参比样品中相应表达产物的水平或功能活性作比较，其中与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中此表达产物的水平或功能活性有差异，表明该测试对象中存在疱疹病毒感染或相关病症。在一些实施方案中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性不同时，所述方法还包括诊断该测试对象中疱疹病毒感染的存在、阶段或程度或相关病症。在这些实施方案中，与各相应表达产物的水平或功能活性相比，所述差异通常表示各表达产物的水平或功能活性至少提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或者甚至至少提高约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％；或者至少降低约10％、20％、30％ 40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或者甚至至少降低约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，即下文所称的“异常表达”。在此类型的示范性例子中，通过检测至少一种选自以下的HVI标记多核苷酸的水平或功能活性降低来测定疱疹病毒感染的存在或相关病症：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQID NO：6、10、19、24、25、29、33、34、35、37、38、41、53、57、61、63、65、66、73、77、83、89、93、94、96、100、101、102、104、106、107或108，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105；(c)含有编码与以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，通过检测至少一种选自以下HVI标记多核苷酸的水平或功能活性的提高来确定疱疹病毒感染的存在或相关病症：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、2、4、8、12、13、15、17、21、23、26、27、31、39、43、45、47、49、51、55、59、67、69、71、75、76、79、81、85、87、91、98、99109、111或113，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114；(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在一些实施方案中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物的所检测水平或功能活性相同或相似时，所述方法还包括诊断不存在疱疹病毒感染或相关病症。在这些实施方案中，各表达产物检测到的水平或功能活性与各相应表达产物检测到的水平或功能活性的差异不超过约20％、18％、16％、14％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％时，下文称为“正常表达”。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78种HVI标记多核苷酸各表达产物的水平或功能活性。例如，所述方法可包括单独检测一种HVI标记多核苷酸或联合检测多至77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种其它HVI标记多核苷酸的水平或功能活性。在另一实施例中，所述方法可包括单独检测一种HVI标记多肽或联合检测多至77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种其它HVI标记多肽的水平或功能活性。在此类型的示范性例子中，所述方法包括检测与存在疱疹病毒感染或相关病症或其风险高度相关(p＜0.00001)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种HVI标记基因(下文称为“一级相关HVI标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25或26，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20或22；(c)含有编码与以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20或22，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在疱疹病毒感染或相关病症或其风险高度相关(p＜0.0001)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种HVI标记基因(下文称为“二级相关HVI标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQID NO：27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在疱疹病毒感染或相关病症或其风险中等相关(p＜0.0003)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种HVI标记基因(下文称为“三级相关HVI标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85或87，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：68、70、72、74、78、80、82、86或88；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：68、70、72、74、78、80、82、86或88，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在其它示范性例子中，所述方法包括检测与存在疱疹病毒感染或相关病症或其风险适度相关(p＜0.06)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16或17种HVI标记基因(下文称为“四级相关HVI标记基因”)各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于：(a)含有与以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有编码与以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有该序列的15个毗连氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)所述序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种一级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种二级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种五级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少1种三级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

在一些实施方案中，所述方法包括检测至少1种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少2种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，所述方法包括检测至少3种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少3种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少4种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少5种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，所述方法包括检测至少6种四级相关HVI标记基因表达产物的水平或功能活性。

生物学样品优选包括宜含有白细胞的血液，特别是外周血。所述表达产物宜选自RNA分子或多肽。在一些实施方案中，所述表达产物与相应的表达产物相同。在其它实施方案中，所述表达产物是相应表达产物的变体(例如，等位基因变体)。

在某些实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶RNA(例如，mRNA)或该靶RNA的DNA拷贝，其水平可用能在低严谨性条件下与该靶RNA或该DNA拷贝杂交的至少一种核酸探针来检测，该核酸探针至少含有某HVI标记多核苷酸的15个毗连核苷酸。在这些实施方案中，将该靶RNA或其DNA拷贝所检测到的水平或丰度按同一样品中存在的参比RNA或该参比RNA的DNA拷贝的水平或丰度标准化。核酸探针宜固定在固体或半固体支持物上。在此类型的示范性例子中，该核酸探针形成核酸探针空间阵列的一部分。在一些实施方案中，通过杂交(例如采用核酸阵列)检测与该靶RNA或该DNA拷贝结合的核酸探针的水平。在其它实施方案中，通过核酸扩增(例如，采用聚合酶链式反应(PCR))检测与该靶RNA或该DNA拷贝结合的核酸探针的水平。在还有其它实施方案中，通过核酸酶保护试验检测与该靶RNA或该DNA拷贝结合的核酸探针的水平。

在其它实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽发生免疫相互作用的至少一种抗原结合分子来检测。在这些实施方案中，将该靶多肽检测到的水平或丰度按同一样品中存在的参比多肽水平标准化。抗原结合分子宜固定于固体或半固体支持物上。在此类型的示范性例子中，该抗原结合分子形成抗原结合分子空间阵列的一部分。在一些实施方案中，用免疫测定(例如利用ELISA)检测与该靶多肽结合的抗原结合分子的水平。

在还有其它实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽反应形成反应产物的至少一种底物来检测。在这些实施方案中，将该靶多肽检测到的功能活性按同一样品中存在的参比多肽的功能活性标准化。

在一些实施方案中，可用适当包括至少一个与基站(base station)相耦联的终端站(end station)的一种系统来执行该诊断方法。该基站宜(a)通过通信网络从终端站接受数据，其中所述数据代表的参数值对应于生物学样品中至少一种表达产物所检测到的或标准化的水平或功能活性，和(b)将所述数据与代表参比样品中至少一种相应表达产物的所检测到的或标准化水平或功能活性的预定数据作比较，从而测定与参比样品中相应表达产物水平或功能活性相比，该生物学样品中此表达产物的水平或功能活性的任何差异。基站最好还能诊断是否存在疱疹病毒感染相关病症或其程度。在这些实施方案中，基站还可通过通信网络将诊断指征传递至终端站。

在另一方面，本发明考虑了采用以上广泛描述的方法来监测、治疗与控制具有可能导致疱疹病毒感染的病况的动物，所述病况的示范性例子包括：免疫抑制、新出生、应激或高强度的运动训练方案。在这些实施方案中，使用本发明诊断方法常能有效监测疱疹病毒感染的早期发生或相关病症，从而能早期治疗性干预与治疗该病症。

在另一方面，本发明提供治疗、预防或抑制对象中疱疹病毒感染或相关病症的方法。这些方法一般包括检测对象中至少一种HVI标记基因的异常表达，给予该对象有效量的药物以治疗或缓解症状，或者逆转或抑制该对象发生疱疹病毒感染或相关病症。这种治疗或药物的代表性例子包括但不限于：抗生素、类固醇与抗炎药物、静脉内(注射)液、血管活性(药物)、损伤或损坏器官的姑息剂支持疗法(例如，呼吸窘迫的供氧，血容量不足输液)与密切监测生命器官。

在另一方面，本发明提供本文称为“HVI标记多核苷酸”的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自：(a)含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO：1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互补序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互补序列，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个毗连核苷酸；(c)至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)或(b)所述序列或其互补序列杂交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸：SEQ ID NO：1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互补序列，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个毗连核苷酸并至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)或(c)所述序列或其互补序列杂交。

在还有另一方面，本发明提供含有操作性连接于调节元件的以上广泛描述的多核苷酸的核酸构建物，该构建物可在宿主细胞中操作。在某些实施方案中，所述构建物是载体形式，特别是表达载体。

在还有另一方面，本发明提供含有以上广泛描述的核酸构建物或载体的分离的宿主细胞。在某些优选实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞。

在还有另一方面，本发明提供用于探查核酸中是否存在以上广泛描述的多核苷酸的探针。这些探针一般包含至少能在低严谨性条件下与以上广泛描述的多核苷酸杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述探针基本上由对应于编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分或与其互补的核酸序列构成：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少长15个核苷酸。在其它实施方案中，所述探针含有至少能在低严谨性条件下与编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少长15个核苷酸。在还有其它实施方案中，所述探针含有至少能在低严谨性条件下与以下序列的至少一部分杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，其中所述部分至少长15个核苷酸。用于检测本发明HVI标记多核苷酸的代表性探针如SEQID NO：145-2150(见表2)所示。

在一相关方面，本发明提供在其上固定了至少一种以上广泛描述的核酸探针的固体或半固体支持物。在一些实施方案中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的核酸探针空间阵列。

在其它方面，本发明提供本文称为“HVI标记多肽”的分离的多肽，所述多肽一般选自：(i)含有与以上广泛描述的HVI标记基因的多肽表达产物至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽，例如，特别是含有与以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的HVI标记基因：SEQ ID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113；(ii)如(i)所述多肽的一部分，其中该部分至少含有该多肽的5个毗连氨基酸残基；(iii)含有与(i)所述多肽的至少15个毗连氨基酸残基至少有30％相似性(和至少31％-至少99％及其之间所有整数百分比)的氨基酸序列的多肽；和(iv)含有能与(i)、(ii)或(iii)所述序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用的氨基酸序列的多肽。

本发明还有一方面提供能与以上广泛描述的HVI标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。

在一相关方面，本发明提供在其上固定了至少一种上述抗原结合分子的固体或半固体支持物。在一些实施方案中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的抗原结合分子空间阵列。

本发明还有另一方面提供一种或多种以上广泛描述的HVI标记多核苷酸、一种或多种以上广泛描述的探针、一种或多种以上广泛描述的HVI标记多肽或一种或多种以上广泛描述的抗原结合分子在制备诊断对象疱疹病毒感染相关病症存在的试剂盒中的应用。

本发明的各方面涉及以上广泛描述的诊断方法、一种或多种以上广泛描述的HVI标记多核苷酸、一种或多种以上广泛描述的探针、一种或多种以上广泛描述的HVI标记多肽或一种或多种以上广泛描述的抗原结合分子用于诊断患疱疹病毒感染相关病症。动物(脊椎动物)、哺乳动物、非人哺乳动物，例如涉及负重或运动(例如竞技)的马与宠物(例如，狗与猫)。

本发明的各方面涉及动物(脊椎动物)、哺乳动物、非人哺乳动物，例如涉及负重或运动(例如竞技)的马与宠物(例如，狗与猫)。

                          附图简述

图1是组1病毒接种动物的接收器操作曲线(Receiver Operator Curve)，比较了第2、4和6天与其它天数的基因表达。利用基因表达标记(signature)的此检验灵敏度和特异性优秀，曲线下面积超过0.9。

图2是利用临床感染动物的选择基因时，接收器操作曲线的图示。利用基因表达标记的检验灵敏度和特异性优秀。

图3是利用视作具有活动性病毒感染的动物的选择基因时，接收器操作曲线的图示。利用基因表达标记的此检验灵敏度和特异性优秀。

图4是利用临床感染动物的所有基因时，接收器操作曲线的图示。利用基因表达特征的此检验灵敏度和特异性良好。

图5是利用视作具有活性病毒感染的动物的选择基因时，接收器操作曲线的图示。利用基因表达特征的此检验灵敏度和特异性良好。

图6是显示EHV-1组1幼驹的基因表达指数(Log强度单位)、血清EHVAb水平(450nm吸光度)、日期、天数(D＝天)和临床体征的示意图。幼驹在2003年3月18日接种(病毒)。基因表达指数的变化对应于存在的临床体征，这种变化发生在特异性血清抗-EHV-1抗体产生的10-14天前。

图7是组1幼驹的主要组分分析示意图。这些组分按照接种(病毒)后的天数作图。

                          发明详述

1.定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。为本发明的目的定义了以下术语。

本文所用的冠词“一”和“一个”指一个或多个(即至少一个)该冠词在语法上的宾语。例如，“一个元件”指一个元件或多个元件。

本文用于描述HVI标记基因表达的术语“异常表达”，指与取自健康对象或未受疱疹病毒感染对象的细胞中某HVI标记基因或其变体的表达水平，和/或与取自健康对象或无疱疹病毒的对象的组织样品或体液中某HVI标记基因产物(例如，转录物或多肽)的较高或较低水平相比，该HVI标记基因过度表达或表达不足。具体地说，如果与取自健康对象或无疱疹病毒的对象的细胞、组织或体液样品中某HVI标记基因的表达水平相比，该HVI标记基因至少高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或甚至至少高约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者低至少约10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少低约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，则该HVI标记基因异常表达。

本文用于描述HVI标记多核苷酸表达的术语“异常表达”，指与取自健康对象或无疱疹病毒感染相关疾病(例如，无活动性疱疹病毒感染)的对象的细胞中某HVI标记多核苷酸或其变体的表达水平，和/或取自健康对象或无疱疹病毒感染疾病的对象的组织样品或体液中某HVI标记多核苷酸产物(例如，转录物或多肽)的较高或较低的水平相比，该HVI标记多核苷酸过度表达或表达不足。具体地说，如果与取自健康对象或无疱疹病毒疾病的对象的细胞、组织或体液样品中某HVI标记基因的表达水平，和/或与取自健康对象或无疱疹病毒疾病的对象的组织样品或体液中某HVI标记多核苷酸的表达水平相比，该HVI标记多核苷酸的表达水平至少高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或甚至至少高约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者至少低约10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少低约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，则该HVI标记多核苷酸异常表达。本发明的免疫系统细胞，特别是循环白细胞中的异常基因表达可从以下两个连续步骤推导：(1)发现异常表达的基因进行诊断、预后与病症评估；和(2)临床确认异常表达的基因。

在按照以下步骤比较多组细胞或组织样品(例如，免疫系统的细胞，例如但不限于白细胞)中受到显著上调或下调(p＜0.06)的那些基因而确定发现异常基因表达：(a)按照在正常与患病状态下表达维持恒定的不变基因来标准化，和(b)采用可防止假阳性的统计学方法(例如，Holm和FDR判断)来解释多变量数据，例如微阵列数据所固有的假阳性发现。基因表达数据分析领域的技术人员知道可采纳数据标准化的其它形式而不会实质改变本发明性质(例如MAS5，稳定的多芯片平均化(Robust multi chip averaging)、GC稳定的多芯片平均化(GC Robust multi chip averaging)或Li Wong算法)。就诊断而言，细胞或组织样品通常得自一组代表感兴趣病症的真阴性细胞或组织样品与一组代表该病症的真阳性细胞或组织样品。这些组中所有其它参数或变量通常需要适当利用相同的动物与诱导该动物发生感兴趣病症来控制，例如年龄、地理位置、性别、运动健康与其它正常的生物学变化。实验设计领域的技术人员知道可采用其它方法来控制其它参数和变量而不会实质性改变本发明性质。这种方法包括但不限于：随机化、阻断(blocking)与利用所分析的共变量(covariates)。就预后而言，细胞或组织样品通常得自一组代表感兴趣病症的真阴性细胞或组织样品与随后(一定时间后)代表该病症的真阳性细胞或组织样品的同一组。这些组中所有其它参数或变量通常需要利用相同的动物，诱导那些动物发生感兴趣病症与随时间变化取自同一动物的样品来控制，例如年龄、地理位置、性别、运动健康与其它正常的生物学变化。就评估而言，细胞或组织样品通常得自与代表感兴趣病症相关的可检测临床参数图谱的一端的一组与代表沿可检测临床参数图谱各点的数组。类似地，这些组中所有其它参数或变量通常需要适当利用相同的动物与诱导该动物发生感兴趣病症来控制，例如年龄、地理位置、性别、运动健康与其它正常的生物学变化。

在发现清单中按照细胞或组织中的不变基因标准化后，证明显著上调或下调的那些基因，并且分析在发现方法中所用的临床细胞或组织样品中感兴趣的情况是能使异常表达的基因在至少75％的时间正确诊断或评估病症的那些基因，从而确定临床确认的异常基因表达。接收器操作曲线(ROC)一般是执行这种诊断的有用检测工具。基因表达数据分析领域的技术人员知道可用其它标准化方法(例如MAS5，稳定的多芯片平均化、GC稳定的多芯片平均化或LiWong算法)代替不变基因标准化方法而不会实质性改变本发明性质。此外，基因表达数据分析领域的技术人员知道可采用许多方法来测定那些基因受到“显著上调或下调”。

“约”指与参比品的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维度、大小、用量、重量或长度相比，最多有30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％不同的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维度、大小、用量、重量或长度变化。

术语“活动性感染”在本文以最广泛的意义使用，包括病毒对宿主的侵入、寄居和/或繁殖，通常伴有一种或多种临床上可能明显或可能不明显的病理学症状。活动性感染包括局部、亚临床或暂时性感染。局部感染可持久存在和通过传播扩展为急性、亚急性或慢性临床感染或疾病状态。当病毒进入淋巴或血管系统时，局部感染也可以变为全身性。“活动性感染”通常指宿主的免疫系统被感染因子激活的感染状态。

术语“扩增子”指扩增的靶序列和/或扩增的靶序列的扩增产物。在某些其它实施方案中，“扩增子”可包含用于扩增的探针或引物序列。

“抗原结合分子”指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应该知道该术语可扩展至显示具有抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。

当本文所用的术语“特异性结合”、“特异性免疫相互作用”等指某抗原结合分子时，此术语指能确定在蛋白质和其它生物制品的异质群体中存在该抗原的结合反应。因此，在所指定的免疫测定条件下，所述抗原结合分子能与其特定抗原相结合而不以明显量与样品中存在的其它蛋白质或抗原相结合。在这种条件下与某抗原的特异性结合可能需要选择对该特定抗原有特异性的抗原结合分子。例如，可制备针对所选蛋白质抗原的抗原结合分子，该分子能与该抗原而非样品中其它蛋白质抗原相结合。可采用各种形式的免疫测定来选择能与某特定蛋白质发生特异性免疫相互作用的抗原结合分子。例如，常规采用固相ELISA免疫测定来选择能与某蛋白质发生特异性免疫相互作用的单克隆抗体。可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件可参见Harlow和Lane，(1988)，“抗体，实验室手册”(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版物，纽约。

“生物学活性部分”指保留了亲代分子活性的全长亲代肽或多肽的一部分。本文所用的术语“生物学活性部分”包括具有亲代分子活性的缺失突变体和具有例如至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000个连续氨基酸残基的肽。可用标准的重组核酸技术来获得或采用常规液相或固相合成技术来合成此类部分。例如，可参考如Blackwell Scientific Publications出版，Nicholson所编的名为《合成疫苗》(Synthetic Vaccines)的出版物中Atherton和Shephard所著名为“肽合成”(Peptide Synthesis)第9章中所述的液相合成或固相合成。或者，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本发明的肽或多肽来制备这类肽。可通过例如高效液相层析(HPLC)技术纯化所消化的片段。也可采用重组核酸技术来制备这种蛋白质。

本文所用的术语“生物学样品”指从动物提取的、未处理、处理、稀释或浓缩的样品。生物学样品可包括生物学液体，例如全血、血清、血浆、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、脑脊液、组织活检(样品)等。在某些实施方案中，生物学样品是血液、特别是外周血。

应理解本文所用的术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”、“顺式调节区”或“调节区”或类似的术语指当置于某可表达遗传序列的适当位置时能调节，至少部分调节该遗传序列表达的任何核苷酸序列。本领域技术人员知道顺式调节区能在转录或翻译后水平上活化、沉默、增强、抑制或者改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的某些实施方案中，顺式作用序列是能增强或刺激某可表达遗传序列表达的激活序列。

除非文中另有需要，本说明书中的词语“包含”和“含有”应理解为指包括某所述步骤或元件或者一组步骤或元件，但不排除任何其它步骤或元件或者一组步骤或元件。

“对应”或“对应于”指以下的多核苷酸：(a)其含有的核苷酸序列与某参比多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补，或(b)其编码的氨基酸序列与某肽或蛋白质的氨基酸序列相同。该短语的范围也包括含有的氨基酸序列与参比肽或蛋白质的氨基酸序列基本上相同的肽或多肽。

在本文治疗或预防某疾病的章节中，“有效量”指将该用量的活性(化合物)以单次剂量或连续剂量的一部分给予需要这种治疗或预防的个体，该用量可有效防止该病症的症状发生、抑制这种症状和/或治疗已有症状。有效量依待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类学组别、组合物的剂型、医学状况的评估和其它相关因素而不同。希望该用量可用常规试验确定具有较宽范围。

术语“表达”或“基因表达”指产生RNA信息或将RNA信息翻译为蛋白质或多肽。采用本文所述方法检测各类型基因表达是本发明的一部分。

“表达载体”指能指导该载体所含的多核苷酸转录和适当地合成该多核苷酸所编码的肽或多肽的任何自主遗传元件。本领域技术人员知道这种表达载体。

本文所用的术语“基因”指细胞基因组的任何与所有的不连续编码区及其相关的非编码和调节区。基因也指编码具体多肽的开放读框、内含子、参与表达调节的毗邻的5’和3’非编码核苷酸序列。在这点上，基因还可含有与某给定基因天然相关的调控信号，例如启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源调控信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可将基因引入合适的载体中而维持于染色体外或整合入宿主。

“高密度多核苷酸阵列”等指每cm²至少含有400个不同元件(feature)的那些阵列。

短语“高度鉴别性杂交条件”指可测定出一个碱基错配的杂交条件。

本文用“杂交”表示互补核苷酸序列配对产生杂交DNA-DNA或杂交DNA-RNA。互补碱基序列是通过碱基配对原则相互关联的那些序列。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与A配对，C与G配对。在这点上，本文所用术语“匹配”和“错配”指互补核酸链中配对核苷酸的杂交可能性。匹配的核苷酸能有效杂交，例如上述典型的A-T和C-G碱基配对。错配是不能有效杂交核苷酸的其它组合。

短语“特异性杂交”等指在严谨性条件下，当某特定核苷酸序列存在于复杂的DNA或RNA混合物(例如，总细胞的)中时，某分子只与该序列结合、形成双螺旋或杂交。

本文提及“免疫相互作用”包括分子之间(特别是在所述分子之一是或模拟免疫系统某组分时)的任何相互作用、反应或其它结合形式。

“免疫功能”或“免疫反应性”指通过本领域熟知的标准试验检测免疫系统对外来抗原的反应能力。

“分离的”表示所述物质实质上或基本上不含其在天然状态下正常伴有的组分。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”指去除了天然状态下其侧接序列的多核苷酸，例如去除了与其正常毗邻序列的DNA片段。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指在体外将肽或多肽分子与其天然细胞环境和与之结合的其它细胞组分相分离和/或纯化。分离的多核苷酸、肽或多肽可以指(不限于)通过分离而纯化的天然序列或通过重组或合成方法产生的序列。

“标记基因”表示能赋予表达该标记基因的细胞独特表型从而使这种转化细胞与不含有该标记的细胞相区别的基因。可选择标记基因赋予等于特性能根据对选择性因子(例如，除草剂、抗生素、辐射、热或其它破坏未转化细胞的处理方法)的抗性进行选择。可筛选标记基因(或报道基因)赋予的性状可通过观察或检验，即通过“筛选”来鉴定(例如，非转化细胞中不存在的β-葡糖醛酸酶、萤光素酶或其它酶活性)。

本文所用的“天然产生的”核酸分子指具有天然产生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能编码天然产生的蛋白质。

“获自”表示某样品，例如细胞提取物或核酸或多肽提取物是分离自或衍生自特定来源。例如，可直接从对象的生物学液体或组织中分离得到提取物。

本文所用的术语“寡核苷酸”指经磷酸二酯键相连的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物，包括含有修饰或取代糖基团等的核苷酸)构成的聚合物(或其相关的结构变体或合成的同类物)。因此，尽管术语“寡核苷酸”通常指其中的核苷酸残基与残基间的连接键是天然存在的核苷酸聚合物，但应知道该术语的范围也包括各种同类物，包括但不限于：肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亚磷酰胺、膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核酸等。该分子的确切大小视具体应用而不同。寡核苷酸是长200个或以下碱基的多核苷酸亚组。寡核苷酸优选长10-60个碱基，最优选长12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。虽然寡核苷酸可以是双链，例如用于构建变体核酸序列，但寡核苷酸通常是单链的，例如探针。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。

术语“寡核苷酸阵列”指含有寡核苷酸探针的基板，在该基板表面的已知不连续位置沉积了不同的已知序列。例如，该基板可以是如美国专利号5,424,186所述的两维基板形式。这种基板可用于合成两维空间寻址的寡核苷酸(矩阵)阵列。或者，该基板的特征在于通过将两维平面的薄片卷成三维管状构型而形成管状阵列。该基板也可采取与光纤表面相连的微球或珠形式，例如Chee等在WO 00/39587中所述的那样。这些寡核苷酸阵列至少具有两种不同的元件，其密度为每cm²至少400个元件。在某些实施方案中，这些阵列的密度可以是每cm²约500、至少一千、至少一万、至少十万、至少一百万或至少一千万个元件。例如，该基板可以是硅或玻璃，具有载玻片或盖玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物构成。当在该基板上进行试验的方法包括光检测时，可用透光的基板。该术语也指探针阵列和与其相连形成晶片一部分的基板。

本文所用的术语“操作性连接”或“操作性相连”表示将结构基因置于启动子的调控下，从而可控制该基因的转录和任选的翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，通常优选将遗传序列或启动子安置在与基因转录起始位点的距离与其天然设置中该遗传序列或启动子与其所调控的基因，即衍生该遗传序列或启动子的基因的距离大体相同。本领域已知可允许对此距离作一些变动而不丧失功能。类似地，调控序列元件与置于其控制下的异源基因的优选定位可利用该元件在其天然设置，即衍生其的基因中的定位来确定。

术语“病原体”在本文以其最广泛的含义使用，指可感染动物活组织的细胞引发疾病反应的生物或感染因子。

本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指至少长10个碱基的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二类核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链或双链形式。

术语“多核苷酸变体”和“变体”指显示与参比多核苷酸序列具有基本序列相同性的多核苷酸，或能在下述严谨性条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括其中有一个或多个核苷酸添加或删除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在这点上，本领域熟知可按照参比多核苷酸对所述多核苷酸作出某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，从而使改变的多核苷酸仍保留该参比多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”也包括天然产生的等位基因变体。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体与合成的同类物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然氨基酸(例如，相应的天然氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然产生的氨基酸聚合物。

术语“多肽变体”指通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而与参比多肽相区别的多肽。在某些实施方案中，参比多肽的一个或多个氨基酸残基可用不同的氨基酸所取代。如下所述，本领域熟知一些氨基酸可以更换成具有大致相似性质的其它氨基酸而不会改变多肽的活性(保守取代)。

“引物”表示当与DNA的一条链配对时在合适的聚合试剂存在下能启动引物延伸产物合成的寡核苷酸。为使扩增效率最大，引物优选单链，但或者可以是双链。引物应足够长从而能在聚合试剂存在时引发合成延伸产物。引物的长度取决于许多因素，包括：应用、所采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂性，引物的3’末端可比模板序列长度短至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1个碱基而能延伸核酸链，虽然引物5’末端长度可延伸超出模板序列的3’末端。在某些实施方案中，引物可以是大的多核苷酸，例如约35个核苷酸到数千碱基以上。可选出与模板序列“基本上互补”的引物，设计的这些引物能与模板杂交并用作合成的起点。“基本上互补”表示该引物的互补性足够与靶多核苷酸杂交。引物和设计与之杂交的模板最好不含错配，但这不是必需的。例如，可将非互补核苷酸残基连接在引物的5’末端，而该引物序列的其余部分与模板互补。或者，可将非互补核苷酸残基或非互补核苷酸残基的延伸段间插入引物中，前提是该引物序列与和其杂交的模板序列的互补性足够而形成合成该引物的延伸产物所需的模板。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有说明，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。取决于杂交条件的严谨性，探针能结合与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸。探针可直接或间接标记，其范围包括引物。

本文所用的术语“重组多核苷酸”指通过操作核酸使其成为自然界中正常未发现形式而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以采取表达载体形式。这种表达载体一般包括操作性连接于该核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。

“重组多肽”表示采用重组技术，即通过重组子或合成的多核苷酸表达而制备的多肽。

“调节元件”或“调节序列”表示在具体宿主细胞中表达操作性相连的编码序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，适用于原核细胞的调节序列包括启动子和任选的顺式作用序列，如操纵子序列与核糖体结合位点。适用于真核细胞的调控序列包括启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的前导和尾随序列，以及使转录的多核苷酸编码产物靶向细胞内区室或靶向胞外环境的导向序列。

本文所用的术语“序列相同性”指二序列在比较窗口上核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的相同性程度。因此，“序列相同性百分比”可通过以下步骤计算：在比较窗口上比较两条最佳比对的序列，测定两条序列中相同的核苷酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)位置数目产生匹配的位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口的总位置数(即，窗口大小)，再将结果乘以100得到序列相同性百分比。为本发明的目的，应将“序列相同性”理解为用DNASIS计算机程序(已有windows的2.5版；购自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，加利福尼亚，美国)，采用该软件所附参考手册中使用的标准默认(参数)计算的“匹配百分比”。

如下表3所定义，“相似性”指相同或构成保守取代的氨基酸百分数。可利用序列比较程序，例如GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research，12，387-395)测定相似性。长度与本文所述序列相似或基本上不同的序列可以此方式在排列中插入空位来比较，这种空位可通过例如GAP所用的比较算法确定。

用于描述两条或以上多核苷酸或多肽之间的序列相关性的术语包括“参比序列”、“比较窗口”、“序列相同性”、“序列相同性百分比”和“基本上相同”。“参比序列”的长度至少12个，但更常见15-18个，往往至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两条多核苷酸各含有(1)两条多核苷酸之间相似的一条序列(即，只是整个多核苷酸序列的一部分)，和(2)两条多核苷酸序列之间有差别的一条序列，则一般通过在“比较窗口”上比较这两条多核苷酸的序列来鉴定和比较局部区域的序列相似性从而在两条(以上)多核苷酸之间进行序列比较。“比较窗口”是含有至少6个，通常约50-约100个，更常见约100-约150个连续位置的概念上的片段，其中某序列与参比序列最佳比对后，该序列与含有相同数目连续位置的参比序列作比较。为(进行)两条序列的最佳比对，与参比序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或以下的添加或缺失(即，空位)。为比对比较窗口，可通过计算机执行算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Drive Madison，WI，美国)，或通过目测和所选择的各种方法之一产生的最佳比对(即导致比较窗口上最高同源性百分比)来对诸序列进行最佳比对。也可如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.，25：3389所述，通过BLAST家族程序进行比对。序列分析详述可见Ausubel等，《最新分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)的第15章，第19.3单元，John Wiley & Sons Inc，1994-1998。

在本文可互换使用的术语“对象”、“个体”或“患者”指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，甚至更特别指哺乳动物对象。本发明范围内合适脊椎动物包括但不限于：灵长类动物、鸟类、家畜(例如，绵羊、母牛、马、驴、猪)、实验室检验动物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，狐、鹿、野狗)。优选的对象是需要治疗或预防疱疹病毒感染或其相关症状的动物，特别是马类动物。然而，应该知道以上术语并未暗示有症状存在。

本文的短语“基本上相似的亲和力”指靶序列在所选择的一组严谨性条件下与它们的互补或基本上互补的寡核苷酸探针杂交强度相似并可检测。

本文所用的术语“模板”指用于产生与该“模板”链互补的核酸链的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互补链也可以是RNA和/或DNA。在某些实施方案中，互补链可包括该“模板”的全部或部分互补序列，和/或可包含突变，因而其不是该“模板”的完全互补链。在本文所述的检测试验以及本领域已知的其它试验中，不与模板链完全互补的链也可以与模板链特异性杂交，这种可用于检测试验的互补链是本发明的一部分。

术语“转化”表示通过引入外源或内源性核酸而改变某生物体，例如细菌、酵母菌、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼或植物的基因型。

术语“治疗”表示治疗性与预防性治疗。

“载体”表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，合适的载体可以是衍生自，例如质粒、细菌噬菌体、酵母菌、病毒、哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并能在确定的宿主细胞，包括靶细胞或组织或其子代细胞或组织中自主复制，或能与确定的宿主细胞基因组整合从而可复制所克隆的序列。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线形或闭环质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可含有确保自身复制的元件。或者，当将载体引入宿主细胞后它能整合入基因组中与所整合入的染色体一起复制。载体系统可包含一种载体或质粒，一起含有引入宿主细胞基因组的总DNA的两种以上载体或质粒，或转座子。选择载体一般取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体也可包含选择标记，例如可用于选择合适转化子的抗生素抗性基因。本领域技术人员已知这种抗性基因的例子。

术语“野生型”和“正常的”可互换使用，指大多数天然产生的物种的特征性表型，其相反的例子是突变体表型。

2.缩写

说明书中使用以下缩写：

nt＝核苷酸

nts＝多个核苷酸

aa＝氨基酸

kb＝千碱基或千碱基对

kDa＝千道尔顿

d＝日

h＝小时

s＝秒

3.疱疹病毒感染的标记及其应用

本发明涉及疱疹病毒感染，特别是EHV感染或其相关病症的早期检测、诊断、监测或预后。本发明公开了感染了疱疹病毒的对象的细胞，特别是血细胞，更具体是外周血细胞中的疱疹病毒感染替代(surrogate)标记，所述标记的形式为特定序列的RNA分子或这些RNA分子表达的多肽。这些标记是疱疹病毒感染的指标，与在正常对象或无疱疹病毒感染对象中的表达相比，当它们差异性表达时可诊断该测试对象发生疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染，或存在风险。与此领域的现有技术相比，这种标记有许多优点。在某些利用外周血进行分析的优选实施方案中，可能在检测到血清抗体前即诊断疱疹病毒感染。

看来本文所述的核酸序列可用于疱疹病毒检测、诊断、预后与治疗各种应用领域。本文范围内这些应用的例子包括利用特异性引物扩增HVI标记、通过与寡核苷酸探针杂交、将分离的核酸掺入载体、使掺入载体的核酸表达为RNA和蛋白质与使对应于该标记所编码产物的免疫学试剂显色来检测HVI标记。

所鉴定的HVI标记进而可用于设计特异性寡核苷酸探针和引物。这种探针和引物可以是能与所鉴定的标记基因序列特异性杂交的任何长度，其至少长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500个核苷酸，而探针可长达本文所鉴定的标记基因序列的全长。探针也可在其5’和/或3’末端包含其它序列从而能延伸超出与其杂交的靶序列。

当联用核酸扩增方法时，这些探针和引物能快速分析生物学样品(例如，外周血样品)检测标记基因或检测或定量测定标记基因的转录物。这种方法包括本领域已知或本文所述用于复制或增加靶核酸或其互补序列的拷贝数或含量的任何方法或技术。

所鉴定的标记也可用于鉴定和分离基因组DNA文库的全长基因序列，包括基因表达的调节元件，宜为(但不限于)马来源的元件。本文鉴定的cDNA序列可用作杂交探针以常规技术来筛检基因组DNA文库。一旦鉴定到部分基因组克隆，可通过“染色体行走”(也称为“重叠杂交”)，采用，例如Chinault和Carbon(1979，Gene，5：111-126)所述的方法来分离全长基因。一旦利用cDNA杂交探针分离得到部分基因组克隆，位于该部分基因组克隆两末端或其附近的非复制型区段可用作杂交探针作进一步基因组文库筛检，最终分离得到感兴趣HVI标记的整个基因序列。应知道可用本文所述的全长或部分cDNA序列或短的表达序列标签(ETS)，采用例如Sambrook等，(《分子克隆.实验室手册》(MOLECULAR CLONING.A LABORATORY MANUAL)，(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物学方法》(CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley & Sons，Inc.，1994)所述的标准技术获得全长基因。此外，可采用公开的，例如以上参考教材中所述的标准技术，利用所述序列来鉴定和分离得到全长cDNA序列。可利用这些技术鉴定和分离的序列，采用本文所述检测方法来检测HVI标记基因，这些序列是本发明的一部分。

本领域普通技术人员能从所鉴定的标记基因中选择一些区段用于作为本发明一部分的各种检测、诊断或预后方法，载体构建物，制备抗原结合分子，试剂盒和/或本文所述任何实施方案。本发明优选使用的标记基因序列是SEQID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113所示的序列。

3.1本发明的核酸分子

如实施例和表1所述，本文提供了通过GeneChip^TM分析从正常马匹和具有EHV临床证据的马匹的血液中鉴定到的63种疱疹病毒标记(即，63种疱疹病毒标记基因)。在这63种标记基因中，44种具有全长或基本上全长的编码序列，其余21种在它们的5’和3’末端的一端或两端具有部分序列信息。所鉴定的HVI标记基因包括21种以前未特征鉴定的马基因。

根据本发明，发现本文所述分离的核酸序列本身可用作杂交探针或扩增引物。这些核酸可用于，例如诊断性评估生物学样品或用于克隆全长cDNA或其相应的基因组克隆。在某些实施方案中，这些探针和引物提供了长度足以和提起自生物学样品的RNA或DNA样品特异性杂交的寡核苷酸。这些序列通常约10-20个核苷酸长，但可以更长。某些实施方案需要较长的序列，例如约30、40、50、100、500个核苷酸和甚至多达全长。

本发明考虑了具有以下SEQ ID NO：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113所示任一序列的约10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500个核苷酸的毗连延伸段的核酸分子。本发明也考虑了与上述序列互补，能在高严谨性条件下与之结合的分子。这些探针可用于各种杂交实施方案，例如Southern和Northern印迹。在一些例子中，本发明考虑可使用能与多种靶序列杂交而不损伤它们有效诊断疱疹病毒感染能力的探针。总之，本发明认为本文所述杂交探针既可用作溶液杂交(如PCR中)的试剂来检测相应基因的表达也可用于固相实施方案中。

设计了围绕所述核苷酸序列的各种探针和引物。例如，在某些实施方案中，用于设计探针和引物的序列可包含通常连接于所鉴定标记基因的RNA两末端的腺嘌呤核苷酸的重复延伸段(poly-A尾)。在其它实施方案中，本领域普通技术人员可能认为某些区段更适用于所述检测方法，故可将探针和引物专门设计为不包含所鉴定标记基因的这些或其它区段。在任何情况中，普通技术人员均能为所选择的应用领域选择引物或探针序列。用于检测HVI标记基因的示范性探针序列见表2。

引物可以是双链或单链形式，虽然单链形式更可取。可将探针设计为能与靶DNA或RNA结合(尽管可能引发)而无需用于扩增方法中。在某些实施方案中，可用放射性物质(³²P、¹⁴C、³⁵S、³H或其它标记物)、荧光团(例如罗丹明、荧光素)或化学发光标记物(例如，萤光素酶)标记这些探针或引物。

本发明提供可用作EHV标记的基本上全长的cDNA序列以及EST或部分cDNA序列。然而，应该知道本文内容不限于这些公开的序列，特别是至少要包括能与含有所公开序列的核酸或这些核酸的变体杂交的分离的核酸。例如，可用核酸的部分序列来鉴定结构相关的基因或其衍生的全长基因组或cDNA克隆。本领域已知可用作上述探针的靶序列的cDNA和基因组文库的制备方法(参见，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有这种核酸以及本文所述的特异性核酸分子统称为“疱疹病毒标记多核苷酸”或“HVI标记多核苷酸”。此外，本发明的范围包括HVI标记多核苷酸的分离或纯化的表达产物(即，RNA转录物和多肽)。

因此，本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质，或其生物学活性部分是基本上或在本质上不含有该核酸分子或蛋白质天然存在环境中发现的与其正常相伴或相互作用的组分。因此，当分离或纯化的多核苷酸或多肽通过重组技术产生时其基本上不含其它细胞物质或培养基成分，或者当它们用化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。“分离的”多核苷酸宜不含产生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的序列(即，位于该多核苷酸的5’和3’末端的序列)，特别是蛋白质的编码序列。例如，在各种实施方案中，分离的HVI标记多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的产生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的多肽包括含有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制品。当本发明的蛋白质或其生物学活性部分用重组方法制备时，培养基宜含有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或非感兴趣蛋白质化学物质。

本发明也包括HVI标记多核苷酸的全长或基本上全长核苷酸序列的各部分，或者它们的转录物或这些转录物的DNA拷贝。HVI标记核苷酸序列的各部分可编码多肽部分或保留该天然多肽生物学活性的区段。或者，可用作杂交探针的HVI标记核苷酸序列的各部分通常不编码保留这种生物学活性的氨基酸序列。因此，HVI标记核苷酸序列的各部分至少含有编码本发明HVI标记多肽的核苷酸序列的约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100个核苷酸，或者几乎多达其全长。

编码本发明HVI标记多肽的生物学活性部分的HVI标记核苷酸序列的一部分至少可编码全长HVI标记多肽中的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少约2000、3000、4000或5000个连续氨基酸残基，或者几乎高达其氨基酸总数。可用作杂交探针或PCR引物的HVI标记核苷酸序列的各部分一般无需编码HVI标记多肽的生物学活性部分。

因此，HVI标记核苷酸序列的一部分可编码HVI标记多肽的生物学活性部分，或者它可以是在本领域已知标准方法中用作杂交探针或PCR引物的片段。可通过分离一条本发明HVI标记核苷酸序列的一部分，表达其所编码的HVI标记多肽的一部分(例如通过体外重组表达)并评估所编码的该HVI标记多肽的一部分(的活性)来制备该HVI标记多肽的生物学活性部分。作为HVI标记核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全长HVI标记核苷酸序列中的约15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650个核苷酸，或者几乎高达其核苷酸总数。

本发明也考虑了HVI标记核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然产生的，例如等位基因变体(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物体)或者可以是非天然产生的。可采用熟知的分子生物学技术，例如本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴定天然产生的变体，例如所述这些变体。可通过诱变技术，包括适用于多核苷酸、细胞或生物体的技术来制备非天然产生的变体。这些变体可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。编码与非编码区可发生变异。变异既可导致保守性也可导致非保守性氨基酸取代(与编码产物相比)。就核苷酸序列而言，保守性变体包括因遗传密码子简并性仍能编码本发明HVI标记多肽之一的氨基酸序列的那些(核酸)序列。变体核苷酸序列也包括合成产生但仍能编码本发明HVI标记多肽的核苷酸序列，例如通过定点诱变产生的那些序列。总体上，通过本文所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明某特定核苷酸序列的变体与该特定核苷酸序列至少具有约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％，一般至少约75％、80％、85％，优选约90％-95％以上，更优选约98％以上的序列相同性。

本发明的HVI标记核苷酸序列可用于分离其它生物体，特别是其它哺乳动物，尤其是其它品种的马的相应序列与等位变体序列。核酸序列的杂交方法在本领域不难获得。可通过熟知技术根据其与本文所述编码序列的序列相同性分离得到其它生物体的编码序列。在这些技术中，可将所有或部分的已知编码序列用作探针，与所选生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(即，基因组或cDNA文库)中存在的其它HVI标记编码序列选择性杂交。因此，本发明也考虑在下述严谨性条件下能与所述HVI标记基因核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。本文所用的术语“在低严谨性、中等严谨性、高严谨性或极高严谨性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指南可见Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。该参考文献中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文提及的低严谨性条件包括至少约1％-至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1-至少约2M的盐，42℃杂交，与至少约1-至少约2M的盐，42℃洗涤。低严谨性条件也可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，65℃杂交，与(i)用2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS，室温洗涤。低严谨性条件的一个实施方案包括约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后至少在50℃(低严谨性条件的洗涤温度可升高至55℃)用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤两次。中等严谨性条件包括至少约16-至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5-至少约0.9M的盐，42℃杂交，与至少约0.1-至少约0.2M的盐，55℃洗涤。中等严谨性条件也可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH7.2)、7％SDS，65℃杂交，与(i)用2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS，60-65℃洗涤。中等严谨性条件的一个实施方案包括约45℃在6×SSC中杂交，然后60℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次以上。高严谨性条件包括至少约31-至少约50％v/v的甲酰胺和约0.01-约0.15M的盐，42℃杂交，与用约0.01-约0.02M的盐，55℃洗涤。高等严谨性条件也可包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，65℃杂交，与(i)用0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、1％SDS，65℃以上温度洗涤。高严谨性条件的一个实施方案包括约45℃在6×SSC中杂交，然后65℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次以上。

在某些实施方案中，HVI标记多肽由能在极高严谨性条件下与所述核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。极高严谨性条件的一个实施方案包括65℃在0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后65℃用0.2×SSC，1％SDS洗涤一次以上。

本领域熟知其它严谨性条件，技术人员知道可操控各种因素来优化杂交的特异性。可优化最终洗涤步骤的严谨性以确保高度杂交。详细例子可参见Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16页和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。

虽然一般在约42℃-68℃的温度下进行严谨性洗涤，但本领域技术人员知道其它温度也适合于严谨性条件。为形成DNA-DNA杂交，最大杂交率一般发生在比T_m低约20℃-25℃的温度。本领域熟知T_m是解链温度，或者是两条互补多核苷酸序列解离的温度。本领域熟知估计T_m的方法(参见Ausubel等，同上，第2.10.8页)。总体上，可利用以下公式预测DNA的最佳匹配双螺旋的T_m近似值：

T_m＝81.5+16.6(log₁₀M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na⁺的浓度，优选0.01-0.4摩尔；％G+C是鸟苷和胞苷碱基之和占碱基总数的百分比，其范围在30％和75％G+C之间；％甲酰胺是以体积计的甲酰胺浓度百分比；长度是DNA双螺旋中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每上升1％，双螺旋DNA的T_m降低约1℃。高严谨性洗涤通常在T_m-15℃时进行，或者中等严谨性在T_m-30℃进行。

在杂交方法的一个例子中，将含有固定DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)42℃在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL变性鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后以中等严谨性连续洗涤该膜两次(即，45℃用2×SSC、0.1％SDS洗涤15分钟，然后50℃用2×SSC、0.1％SDS洗涤15分钟)，再以较高严谨性连续洗涤两次(即，55℃用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤12分钟，然后65-68℃用0.2×SSC、0.1％SDS溶液洗涤12分钟)。

3.2本发明的多肽

本发明也考虑了本发明HVI标记基因编码的全长多肽以及那些多肽的生物学活性部分，在本文统称为“疱疹病毒感染标记多核苷酸”或“HVI标记多肽”。全长HVI标记多肽的生物学活性部分包含至少长约6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60个氨基酸残基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本发明所考虑的免疫相互作用片段至少长6个，优选至少8个氨基酸残基，它们能在动物中引发免疫反应从而产生能与本发明HVI标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。可用这种抗原结合分子筛检其它哺乳动物，特别是马类哺乳动物中结构和/或功能相关的HVI标记多肽。全长HVI标记多肽的各部分一般可能参与某种相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬时性，可形成或打断某共价键)。全长HVI标记多肽的生物学活性部分包括含有与某(假定的)全长HVI标记多肽的氨基酸序列，例如以下所示的氨基酸序列足够相似或衍生自该氨基酸序列的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，这些序列含有少于全长HVI标记多肽的氨基酸并至少显示该多肽的一种活性。生物学活性部分通常包含至少具有全长HVI标记多肽一种活性的结构域或基序。全长HVI标记多肽的生物学活性部分可以是长，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000，或者甚至至少约2000、3000、4000或5000个以上氨基酸残基的多肽。所述部分宜是含有不低于衍生其的全长多肽的约1％、10％、25％、50％活性的“生物学活性部分”。

本发明也考虑了变体HVI标记多肽。“变体”多肽包括通过以下方式从天然蛋白质衍生的蛋白质：在该天然蛋白质的N-末端和/或C-末端删除(称为截短)或添加一个或多个氨基酸；在该天然蛋白质的一个或多个位点处删除或添加一个或多个氨基酸；或者在该天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。本发明的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍具有该天然蛋白质的所需生物学活性。例如，遗传多态性或人为操作可形成这种变体。通过本文所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明的天然HVI标记蛋白质的生物学活性变体与该天然蛋白质的氨基酸序列可具有至少40％、50％、60％、70％，一般至少75％、80％、85％，优选约90％-95％以上，更优选约98％以上的序列相似性。本发明蛋白质的生物学活性变体与该蛋白质一般可有多达1000、500、400、300、200、100、50或20个氨基酸残基，或者宜少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)、少至5个、少至4、3、2或者甚至1个氨基酸残基不同。

可以各种方式改变本发明的HVI标记多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。本领域一般知道这种操作方法。例如，可通过DNA突变制备HVI标记蛋白质的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变与核苷酸序列改变的方法。参见，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492)，Kunkel等，(1987，Methods in Enzymol.，154：367-382)，美国专利号4,873,192；Watson，J.D.等，(《基因的分子生物学》(Molecular Biology of the Gene)，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，1987)和它们所引用的参考文献。适当进行氨基酸取代而不影响感兴趣蛋白质的生物学活性的指南见Dayhoff等，(1978)，《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequenceand Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型。本领域已知筛选含有所选特性的通过点突变或截短(方法)制备的组合文库基因产物和筛选cDNA文库基因产物的方法。这种方法适用于快速筛选通过组合诱变产生的HVI标记多肽的基因文库。可联用能提高该文库中功能性突变频率的技术-递推集团诱变(REM)与筛选试验来鉴定HVI标记多肽变体(Arkin和Yourvan，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：7811-7815；Delgrave等，(1993)，Protein Engineering，6：327-331)。下文详述了理想的保守性取代，例如用另一个具有相似特性的氨基酸替换某一氨基酸。

与亲代HVI标记氨基酸序列相比，变体HVI标记多肽在沿它们序列的不同位置可含有保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是用具有相似侧链的氨基酸残基取代某氨基酸残基。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，它们一般可再分为：

酸性：该残基因在生理pH下失去H离子而带负电荷，该残基受水溶液吸引，因此当包含它的肽处于生理pH水性介质中时，此残基处于该肽构型的表面位置。含有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性：该残基因在生理pH下或在其一两个pH单位内结合H离子而带正电荷(例如，组氨酸)，该残基受水溶液吸引，因此当包含它的肽处于生理pH水性介质中时，此残基处于该肽构型的表面位置。含有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电荷的：这些残基在生理pH时带电荷，因此包括含有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水性：这些残基在生理pH下不带电荷并被水溶液所排斥，因此当包含它的肽处于水性介质中时，此残基处于该肽构型的内部位置。含有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性/极性：这些残基在生理pH下不带电荷，但水溶液不足以排斥它们，因此当包含该残基的肽处于水性介质中时，此残基吸附于该肽构型的内部位置。含有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

本说明书也将某些氨基酸特征鉴定为“小的”氨基酸，因为它们的侧链不够大(即使缺乏极性基团)因而不能赋予疏水性。除脯氨酸以外，“小的”氨基酸是当侧链上有至少一个极性基团时具有4个以下碳，和当侧链上没有极性基团时具有3个以下碳的那些氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸--脯氨酸因已知其对肽链的二级构型有影响而成为特例。脯氨酸的结构因其侧链与α-氨基的氮原子以及α-碳原子结合而不同于所有其它天然产生的氨基酸。例如Dayhoff等((1978)，“蛋白质进化改变的模型”(A model of evolutionary change in proteins))公开了几种氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵)。然而，刊于M.O.Dayhoff编的《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence andStructure)，第5卷，第345-358页，国家生物医学研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation)，Washington DC；和Gonnet等，1992，Science，256(5062)：144301445中用于测定远程关系的矩阵将脯氨酸包括在甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的同一组中。因此，为本发明的目的将脯氨酸归类为“小”氨基酸。

将(氨基酸)分为极性或非极性类别所需的吸引或排斥程度是随意的，因此本发明专门考虑的氨基酸可分为一类或另一类。可根据已知的性能对大多数未专门命名的氨基酸进行分类。

氨基酸残基还可再分为环状或非环状，芳香族或非芳香族，根据残基的侧链取代基可自圆其说分类，与分成小的或大的。如果某残基总共含有4个以下碳原子(包括羧基碳)，认为其是小氨基酸，前提是存在其它极性取代基；如果不存在其它极性取代基，总共含3个以下碳原子的残基可认为是小氨基酸。小残基当然总是非芳香族残基。可根据氨基酸残基的结构性能将其分入两种以上的种类。就天然产生的蛋白质氨基酸而言，根据此方案的亚分类见表3。

保守性氨基酸取代也包括根据侧链分类。例如，含有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；含有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；含有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸相似地取代某种氨基酸时不会严重影响所产生的变体多肽的性能。氨基酸改变是否能产生功能性HVI标记多肽不难通过检验其活性来测定。保守性取代见表4的示范性取代的标题。更优选的取代见优选取代标题。本发明范围内的氨基酸取代一般通过所选择的取代基对维持：(a)取代区域肽骨架结构，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积没有明显不同作用的取代来实现。引入取代后，筛选具有生物学活性的变体。

或者，可根据侧链的相同性将制备保守性取代的相似氨基酸分为三类。如Zubay，G.，《生物化学》(Biochemistry)，第三版，Wm.C.Brown Publishers，(1993)所述，第一组包括均含有带电荷侧链的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。

因此，通常用相同侧链家族中的另一氨基酸残基取代HVI标记多肽中预计的非必需氨基酸残基。或者，可沿着HVI标记基因编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，然后筛选得到的突变体有无亲代多肽的活性来鉴定保留了该活性的突变体。诱变编码序列后，可重组表达所编码的肽，测定该肽的活性。

因此，本发明也考虑天然产生的HVI标记多肽序列的变体或它们的生物学活性片段，其中所述变体可通过添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而与天然产生的序列相区别。总体上，变体可显示与亲代HVI标记多肽序列，例如以下SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。变体优选与亲代HVI标记多肽序列，例如以下SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列相同性。此外，本发明考虑通过添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500个以上氨基酸而与天然或亲代序列不同但仍保留了该亲代HVI标记多肽特性的序列。HVI标记多肽也包括能在本文所定义的严谨条件下，特别是高严谨条件下与上述本发明HVI标记多核苷酸序列或其非编码链杂交的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方案中，变体多肽与HVI标记序列有至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基不同。在另一实施方案中，变体多肽与以下SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示的相应序列有至少1％但低于20％、15％、10％或5％的残基不同。(如果此比较(方法)需要比对，则应比对这些序列的最大相似性。因缺失或插入或错配所产生的“环”外序列可认为有差别)。这些差别优选是位于非必需残基的差别或改变，或保守性取代。

“非必需”氨基酸残基是可从某具体多肽的野生型序列中改变而不破坏或基本上不改变其一种或多种活性的残基。所述改变优选基本上不改变这些活性之一，例如野生型活性的20％、40％、60％、70％或80％。“必需”氨基酸残基是当改变本发明HVI标记多肽野生型序列的该残基时会破坏该亲代分子的活性从而低于野生型多肽的活性20％。

在其它实施方案中，变体多肽包括与HVI标记多肽的相应序列，例如以下SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或以上相似性并具有该HVI标记多肽活性的氨基酸序列。

可通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备本发明的HVI标记多肽。例如，可通过包括以下步骤的方法制备这些多肽：(a)制备含有编码某HVI标记多核苷酸至少一部分并与调节元件操作性相连的核苷酸序列的嵌合型构建物；(b)将该嵌合型构建物引入宿主细胞中；(c)培养该宿主细胞表达该HVI标记多肽；和(d)从宿主细胞中分离该HVI标记多肽。在示范性的例子中，所述核苷酸序列编码以下SEQ ID NO：3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示序列，或其变体的至少一部分。

嵌合型构建物通常采取表达载体的形式，宜选自自身复制的染色体外载体(例如质粒)和能整合入宿主基因组中的载体。

调节元件一般应适合于表达该HVI标记多肽所用的宿主细胞。本领域已知各种宿主细胞的许多类型的表达载体和调节元件。此类型的示范性元件包括但不限于：启动子序列(例如可以是天然产生的组成型或可诱导启动子或具有多种启动子的组合元件)、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列及增强子或激活序列。

在一些实施方案中，表达载体包含可选择的标记基因以选择转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域熟知的并随所用的宿主细胞而不同。

所述表达载体也可包含融合伴侣(通常由该表达载体提供)从而可将HVI标记多肽制备为含有融合伴侣的融合多肽。融合伴侣的主要优点是它们有助于鉴定和/或纯化该融合多肽。为制备融合多肽，需要将HVI标记多核苷酸连接入表达载体中使融合伴侣与HVI标记多核苷酸的翻译读框重合。融合伴侣的熟知例子包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六个组氨酸(hexahistidine)(HIS₆)，这些伴侣特别可用于通过亲和层析分离融合多肽。在一些实施方案中，可利用与融合伴侣结合的基质(例如但不限于：谷胱甘肽-、直链淀粉-和镍-或钴-偶联树脂)通过亲和层析纯化这些融合多肽。许多这种基质可以“试剂盒”形式购得，例如利用(HIS₆)伴侣的QIAexpress^TM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。本领域已知的其它融合伴侣是发光蛋白质，例如可用作荧光“标签”通过荧光显微术或流式细胞术来鉴定和/或分离融合多肽的绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶。流式细胞术方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)法在该后一应用中特别有用。

融合伴侣也优选含有蛋白酶切割位点，例如因子X_a或凝血酶的切割位点，从而使相关蛋白酶能部分消化该融合多肽而从融合构建物中释放出HVI标记多肽。随后可通过层析分离方法分离所释放的多肽与融合伴侣。

融合伴侣的范围也包括“表位标签”，这些标签通常是可购得其特异性抗体的短肽序列。易于购得特异性单克隆抗体的表位标签的熟知例子包括c-Myc、流感病毒血凝素和FLAG标签。

可通过包括“转导”和“转染”等适当方法将本发明的嵌合型构建物引入宿主中，这在技术上意味着通过核酸介导的基因转移将核酸，例如表达载体引入受者细胞中。然而，“转化”指宿主的基因型因细胞摄入外源性DNA或RNA而改变的过程，例如转化细胞含有本发明的表达系统。将嵌合型构建物引入细胞有许多方法。所用的方法一般取决于宿主细胞的选择。本领域技术人员熟知将嵌合型构建物引入宿主细胞的技术。已描述了四类将核酸分子递送入细胞的方法：(1)化学方法，例如磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)-介导的沉淀和脂质转染；(2)物理方法，例如显微注射、电穿孔、加速方法和真空渗入；(3)载体方法，例如细菌和病毒载体介导的转化；和(4)受体介导的转化。本领域技术人员熟知这些和其它类型的转化技术，而新的技术也不断涌现。具体选择转化技术取决于该技术转化特定宿主细胞的效率以及采用具体选择的方法实施本发明之人的经验和偏好。技术人员明显可知将嵌合型构建物引入细胞中的转化系统的具体选择不是实质性的或对本发明的限制，只要该系统能实现可接受的核酸转移水平。

可通过培养经嵌合型构建物转化的宿主细胞来制备重组HVI标记多肽。适合表达HVI标记多肽的条件随所选表达载体和宿主细胞而不同，技术人员通过常规实验不难确定这些条件。适合表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。表达本发明多肽的示范性宿主细胞是细菌。所用的细菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。或者，宿主细胞可以是酵母菌细胞或昆虫细胞，例如利用杆状病毒表达系统的SF9细胞。

可采用如Sambrook等，(1989，同上)，特别是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特别是第10和16章；和Coligan等，《蛋白质科学的最新方法》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)，(John Wiley& Sons，Inc.，1995-1997)，特别是第1、5和6章中所述的标准方法不难制备重组HVI标记多肽。或者，可通过化学合成，例如采用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，Science，269：202)中所述的液相合成或固相合成法来化学合成HVI标记多肽。

4.抗原结合分子

本发明也提供可与本发明HVI标记多肽发生特异性免疫相互作用的抗原结合分子。在一个实施方案中，该抗原结合分子包括多克隆全抗体。可通过，例如将本发明的HVI标记多肽注射入能产生(抗体)的动物(包括小鼠和家兔)以获得多克隆抗血清来制备这种抗体。本领域技术人员熟知制备多克隆抗体的方法。可采用的示范性方法见，例如Coligan等，《免疫学最新方法》(CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)，(John Wiley & Sons，Inc，1991)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特别是第11章的第III部分。

可采用，例如K_hler和Milstein(1975，Nature，256，495-497)所述的标准方法或采用，例如Coligan等，(1991，同上)所述的最新改进方法，用得自接种了一种或多种本发明HVI标记多肽的产生(抗体的)动物的无限增殖脾细胞或其它抗体产生细胞来制备单克隆抗体，替代从产生(抗体的)动物得到的多克隆抗血清。

本发明也考虑用Fv、Fab、Fab′和F(ab′)₂免疫球蛋白片段作为抗原结合分子。或者，抗原结合分子可包括合成的稳定的Fv片段。此类型的示范性片段包括用肽接头分别桥连V_H结构域的N末端或C末端与V_L结构域的C末端或N-末端的单链Fv片段(sFv，通常称为scFv)。ScFv缺乏完整抗体的所有恒定区，因而不能激活补体。可根据，例如Kreber等(Kreber等，1997，J.Immunol.Methods，201(1)：35-55)所概述的方法制备ScFv。或者，可通过美国专利号5,091,513；欧洲专利号239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Nature，349：293)和Plückthun等(1996，刊于《抗体工程改造：一种实用方法》(Antibodyengineering：A practical approach)，203-252)所述的方法制备它们。在另一实施方案中，合成的稳定的Fv片段包括二硫键稳定的Fv(dsFv)，在该片段中将两个半胱氨酸残基引入V_H和V_L结构域中从而在完全折叠的分子中此二残基彼此间形成二硫键。产生dsFv的合适方法描述于，例如(Glockscuther等，Biochem.，29：1363-1367；Reiter等，1994，J.Biol.Chem.，269：18327-18331；Reiter等，1994，Biochem.，33：5451-5459；Reiter等，1994，Cancer Res.，54：2714-2718；Webber等，1995，Mol.Immunol.，32：249-258)。

本领域已知制备抗-HVI标记多肽的抗原结合分子的噬菌体展示与组合方法(例如，以下文献中所述的：Ladner等，美国专利号5,223,409；Kang等，国际公布号WO 92/18619；Dower等，国际公布号WO 91/17271；Winter等，国际公布WO 92/20791；Markland等，国际公布号WO 92/15679；Breitling等，国际公布WO 93/01288；McCafferty等，国际公布号WO 92/01047；Garrard等，国际公布号WO 92/09690；Ladner等，国际公布号WO 90/02809；Fuchs等，(1991)，Bio/Technology，9：1370-1372；Hay等，(1992)，Hum Antibod Hybridomas，3：81-85；Huse等，(1989)，Science，246：1275-1281；Griffths等，(1993)，EMBOJ，12：725-734；Hawkins等，(1992)，J Mol Biol，226：889-896；Clackson等，(1991)，Nature，352：624-628；Gram等，(1992)，PNAS，89：3576-3580；Garrad等，(1991)，Bio/Technology，9：1373-1377；Hoogenboom等，(1991)，Nuc AcidRes，19：4133-4137；和Barbas等，(1991)，PNAS，88：7978-7982)。这些抗原结合分子可用于筛选表达文库中的变体HVI标记多肽。它们也可用于检测和/或分离本发明的HVI标记多肽。因此，本发明也考虑利用这些抗原结合分子，采用例如任何合适的免疫亲和方法(包括但不限于免疫层析和免疫沉淀)来分离HVI标记多肽。合适的方法利用固相吸附，其中将抗-HVI标记多肽的抗原结合分子与合适的树脂相连，使该树脂与怀疑含有HVI标记多肽的样品接触，然后从树脂上洗脱HVI标记多肽(如果存在的话)。示范性树脂包括：Sepharose^TM(Pharmacia)、Poros^TM树脂(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis)、ActigelSuperflow^TM树脂(Sterogene Bioseparations Inc.，Carlsbad Calif.)和Dynabeads^TM(Dynal Inc.，Lake Success，N.Y.)。

可将抗原结合分子与化合物，例如标记物，如放射性核素，或成像试剂，如放射性、酶活性(试剂)或其它成像试剂，如NMR对比试剂相偶联。优选能产生可检测的放射性射线或荧光的标记物。为评估蛋白质表达的丰度和模式，可利用抗-HVI标记多肽的抗原结合分子(例如，单克隆抗体)来检测HVI标记多肽(例如，在细胞裂解物或细胞上清液中的)。在本发明的某些优选应用中，可用这种抗原结合分子来监测生物学样品(含有完整的细胞和液体)中的HVI标记多肽水平而诊断是否存在疱疹病毒感染及其程度或疱疹病毒感染所致疾病的风险。将抗体与可检测物质(即，抗体标记)相偶联(即，物理连接)有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素与亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、荧光素和水母蛋白；合适的放射性材料的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。标记物可选自色原、催化剂、酶、荧光基团、化学发光分子、镧系离子，如铕(Eu³⁴)、放射性同位素和可直接观察的标记物。就可直接观察标记物而言，可用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它载体等制备标记。

美国专利说明书U.S.4,366,241；U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公开了大量可用作标记物的酶。本发明可用的酶标记物包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。可单独使用酶标记物溶液或与第二种酶联用。

5.检测异常HVI标记基因表达或等位基因的方法

本发明部分基于以下发现：与未受疱疹病毒感染的马匹相比，受疱疹病毒(特别是EHV)感染的马匹，特别是活动性疱疹病毒感染的那些马匹的某些基因或者这些基因的某些等位基因(本文称为HVI标记基因)表达异常。本文提出在受疱疹病毒感染的其它动物中发现这些基因或它们的同源物或直向同源物的表达异常。因此，本发明的特征在于通过检测取自对象的生物学样品中某HVI标记基因的异常表达来评估该对象(优选哺乳动物)的疱疹病毒感染或诊断疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染的方法。疱疹病毒感染宜包括受选自α疱疹病毒科、β疱疹病毒科和γ疱疹病毒科的疱疹病毒亚科成员之一感染。α疱疹病毒科亚科的疱疹病毒的示范性例子包括：HHV-1(HSV-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(VZV)和马疱疹病毒(如，EHV-1和EHV-4)。β疱疹病毒科亚科的疱疹病毒的非限制性例子包括：HHV-5(CMV)、HHV-6(玫瑰疹病毒)和HHV-7。γ疱疹病毒科亚科的疱疹病毒的代表性例子包括但不限于：HHV-4(淋巴潜隐病毒，EBV)和HHV-8(细长病毒)。在特定的实施方案中，所述疱疹病毒是EHV，特别是EHV-1，更特别是活动性EHV-1。

为作出评估或诊断，需要定性或定量测定HVI标记基因转录物的水平、某HVI标记基因的特定等位基因的存在或水平或HVI标记多肽的水平或功能活性。在一些实施方案中，当生物学样品中存在的某HVI标记基因产物检测水平低于取自正常对象或未受疱疹病毒感染，特别是未受疱疹病毒活动性感染对象的参比样品中该基因的水平时，可诊断存在疱疹病毒感染状态、程度或阶段，或者存在发生疱疹病毒后遗症风险。在其它实施方案中，当生物学样品中某HVI标记基因产物的可检测水平高于取自正常对象或未受疱疹病毒感染，特别是未受疱疹病毒活动性感染对象的参比样品该基因的水平时，则可诊断存在疱疹病毒感染状态、程度或阶段，或者存在发生疱疹病毒后遗症风险。总之，当生物学样品中的某HVI标记基因产物的水平或功能活性与参比样品中相应的HVI标记基因产物的水平或功能活性相比至少有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少约99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，或甚至至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的差异时，可作出这种诊断。代表性HVI标记基因表达水平的示范性升高或降低见表5-7。

相应的基因产物通常选自生物学样品中存在的同一基因产物、含有等位基因变体或剪接变体的变体基因(例如，同源或直向同源基因)所表达的基因产物或它们的蛋白质产物。在一些实施方案中，该方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种HVI标记基因各表达产物的水平或功能活性。

生物学样品一般包括血液，特别是外周血，或其组分或提取物。生物学样品通常含有血细胞，例如成熟、不成熟和发育的白细胞，包括淋巴细胞、多形核白细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、网织红细胞、嗜碱性粒细胞、腔胞、血细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞、树突细胞、天然杀伤细胞，或这些细胞的组分(例如，核酸或蛋白质部分)。在特定的实施方案中，生物学样品含有白细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)。

5.1核酸诊断

可按照标准方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)从生物学样品所含细胞中分离核酸用于多核苷酸试验。所述核酸一般是分级的(例如，poly A⁺RNA)或全细胞RNA。当将RNA作为检测对象时，需要将RNA转变为互补DNA。在一些实施方案中，采用模板依赖性核酸扩增技术扩增该核酸。已有许多模板依赖性方法来扩增某给定模板样品中存在的HVI标记序列。示范性核酸扩增技术详述于美国专利号4,683,195；4,683,202和4,800,159；Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCRProtocols)，Academic Press，Inc.，San Diego Calif.，1990)中的聚合酶链式反应(称为PCR)。简言之，在PCR中，制备与该标记序列的相对互补链上区域互补的两条引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。如果某样品中存在同源HVI标记序列，这些引物将与该标记(序列)结合，聚合酶可通过添加核苷酸使该引物沿着标记序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物可与标记(序列)解离形成反应产物，过量的引物可与标记(序列)和反应产物结合，而反复进行该过程。为定量测定所扩增的mRNA含量，可采用逆转录酶PCR扩增方法。将RNA逆转录为cDNA的方法是熟知的，其描述于Sambrook等，1989，同上。其它逆转录方法利用热稳定的RNA依赖性DNA聚合酶。WO90/07641描述了这些方法。本领域熟知聚合酶链式反应方法。

在某些优选实施方案中，模板依赖性扩增包括实时定量测定转录物。例如，可采用实时PCR技术(Higuchi等，1992，Biotechnology，10：413-417)定量测定RNA或DNA。通过测定PCR反应中完成相同数目扩增轮次并处于线性范围内的靶DNA扩增产物的浓度，可以确定原始DNA混合物中特异性靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNA合成的cDNA，则可测定产生该靶序列的各组织或细胞的特异性mRNA的相对丰度。PCR产物的浓度与mRNA相对丰度之间的这种直接正比例关系只在PCR反应的线性范围内才正确。可通过反应混合物中试剂的利用率测定该曲线平台部分靶DNA的终浓度，该终浓度不依赖于该靶DNA的初始浓度。

另一扩增方法是EPO No.320 308所公开的连接酶链式反应(“LCR”)。在LCR中，制备两对互补探针，在靶序列存在下每对探针与靶序列的相反互补链结合从而使它们毗邻。在连接酶存在下，此两对探针可相连形成一个单位。与PCR中一样，通过温度循环，使结合的连接单位从靶序列上解离，然后用作连接过量探针对的“靶序列”。美国专利号4,883,750描述了与LCR相似，使探针对和靶序列结合的方法。

也可使用PCT申请号PCT/US87/00880所述的Qβ复制酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下将具有与靶序列某区域相互补区域的RNA复制序列加入样品中。聚合酶可拷贝该复制序列，然后检测。

利用限制性核酸内切酶和连接酶扩增在一条链的限制性位点含有核苷酸5′α-硫代-三磷酸的靶分子的恒温扩增方法也可用于扩增本发明的核酸，Walker等，(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，89：392-396)。

链置换扩增(SDA)是进行核酸恒温扩增的另一种方法，该方法包括多轮链置换与合成，即切口平移。称为修复链式反应(RCR)的相似方法包括使几种探针在扩增的整个靶区域上退火，然后只对四种碱基中的两种进行修复反应。为便于检测将另两种碱基作为生物素化衍生物加入。SDA中采用了类似的方法。也可采用循环探针反应(CPR)检测特异性靶序列。在CPR中，具有非特异性DNA的3’和5’序列与特异性RNA中段序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNA酶H处理反应(混合物)，探针的产物鉴定为消化后释放的不同产物。使原始模板与另一循环探针退火，重复进行此反应。

还可采用英国专利申请号2 202 328和PCT申请号PCT/US89/01025所述的另一种扩增方法。在前一申请中，将“修饰的”引物用于PCR-样的模板和酶依赖性合成中。可用捕获部分(例如，生物素)和/或检测部分(例如，酶)标记修饰这些引物。在后一申请中，将过量的标记探针加入样品。在靶序列存在下，探针结合并被酶催化切割。切割后，靶序列完整释放进而与过量探针结合。标记探针的切割是靶序列存在的信号。

其它核酸扩增方法包括转录扩增系统(TAS)，包括核酸序列扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：1173；Gingeras等，PCT申请WO 88/10315)。在NASBA中，可通过临床样品的标准苯酚/氯仿提取、热变性、裂解缓冲液处理和微量离心(minispin)柱分离DNA和RNA或通过氯化胍提取RNA来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术包括使具有靶特异性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化杂交的DNA/RNA杂交体，对双链DNA分子再进行热变性。在两种情况中，通过加入第二条靶特异性引物然后聚合从而将单链DNA制成完全双链。然后用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次转录该双链DNA分子。在恒温循环反应中，将RNA逆转录为单链DNA，然后转变为双链DNA，接着用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次转录。得到的产物无论是截短的还是完整的均显示为靶特异性序列。

Davey等，EPO No.329 822公开了一种核酸扩增方法，包括可用于本发明的循环合成的单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。ssRNA是逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然后利用核糖核酸酶H(RNA酶H，对含DNA或RNA的双螺旋中RNA具有特异性的RNA酶)的作用除去得到的DNA:RNA双螺旋中的RNA。产生的ssDNA是第二引物的模板，该引物在5’(端)也含有与该模板同源的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)的启动子序列。然后用DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸此引物，得到双链DNA(“dsDNA”)分子，其序列与引物之间的原始RNA相同，在一末端还含有启动子序列。合适的RNA聚合酶可利用此引物序列制备该DNA的多份RNA拷贝。然后这些拷贝可再进入循环从而快速扩增。适当地选择酶，可恒温进行此扩增(方法)而无需在每轮加入酶。由于此方法的循环性质，可选择DNA或RNA形式的起始序列。

Miller等在PCT申请WO 89/06700中公开的核酸序列扩增方案根据启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssDNA”)杂交，然后转录该序列的多份RNA拷贝。此方案不是循环性的，即得到的RNA转录物不产生新模板。其它扩增方法包括“RACE”和“单边(one-sided)PCR”(Frohman，M.A.，刊于《PCR方法：方法与应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications)，科学出版社，N.Y.，1990；Ohara等，1989，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，86：5673-567)。

也可采用在含有所产生的“二-寡核苷酸”序列的核酸存在下连接两条(或多条)寡核苷酸从而扩增该“二-寡核苷酸”的方法来扩增靶核酸序列。Wu等，(1989，Genomics，4：560)。

取决于所用的方式，可采用例如上述模板依赖性扩增或在扩增后用第二种已知的核酸直接鉴定样品中感兴趣的HVI标记核酸。然后检测所鉴定的产物。在某些应用中，可通过目测方法进行检测(例如，凝胶溴化乙锭染色)。或者，检测可包括通过化学发光、放射性标记的放射性闪烁照相术或荧光标记物或甚至通过利用电或热脉冲信号的系统来间接鉴定产物(Affymax Technology；Bellus，1994，J Macromol.Sci.Pure，Appl.Chem.，A31(1)：1355-1376)。

在一些实施方案中，可观察扩增产物或“扩增子”以证实HVI标记序列的扩增。一种典型的目测方法包括用溴化乙锭染色凝胶，在UV光下观察。或者，如果扩增产物整合标记了放射性或荧光标记的核苷酸，可在分离后使这些扩增产物曝光x-射线胶片或在合适的激发光谱下观察。在一些实施方案中，可间接进行观察。扩增产物分离后，使标记的核酸探针与扩增的HVI标记序列接触。探针优选与生色团偶联，但也可放射性标记。或者，将探针与结合伴侣，例如抗原结合分子或生物素偶联，而结合对的另一成员携带可检测部分或报导分子。所涉及的技术是本领域技术人员熟知的，可在许多分子方法的标准教科书(例如，参见Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，可在扩增期间或其后用生色团或放射性标记的探针或引物鉴定靶(序列)。

在某些实施方案中，采用本领域技术人员熟知的印迹技术定量测定靶核酸。Sourthern印迹利用DNA作为靶子，而Northern印迹利用RNA作为靶子。各方法可提供不同类型的信息，虽然cDNA印迹在许多方面与上述印迹或RNA相似。简言之，探针用于靶向固定于合适的基质上，通常是硝酸纤维素膜上的DNA或RNA。不同种类核酸在空间上应分开以便分析。这往往通过核酸凝胶电泳，然后“印迹”到膜上来实现。随后，在促进变性和再杂交(rehybridisation)的条件下共同培育印迹靶(序列)与探针(通常是标记的探针)。因为探针设计为与靶(序列)碱基配对，探针可在复性条件下与靶序列的一部分结合。然后除去未结合的探针，如上所述进行检测。

检测/定量测定后，可将某给定对象的所见结果与对照反应(结果)或正常对象或无疱疹病毒感染，特别是无活动性疱疹病毒感染对象的有统计学意义的参比组作比较。以此方式可使所检测到的HVI标记核酸含量与疾病的进程或严重性相关联。

本发明也考虑如Kristensen等，(Biotechniques，30(2)：318-322)所述的基因分型方法和等位基因鉴别方法和技术，这些方法和技术包括采用单个核苷酸多态性分析、高效液相层析、TaqMan^TM、液相层析和质谱。

本发明也考虑生物芯片技术，例如Hacia等(1996，Nature Genetics，14：441-447)和Shoemaker等(1996，Nature Genetics，14：450-456)所述的技术。简言之，这些技术包括快速精确分析许多基因的定量测定方法。通过用寡核苷酸给基因加标签或者利用固定的探针阵列，可用生物芯片技术将靶分子分隔成高密度阵列并根据杂交筛选这些分子。也参见Pease等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：5022-5026)；Fodor等(1991，Science，251：767-773)。简言之，如本文所概述，制备HVI标记多核苷酸的核酸探针，将其与用于筛选和诊断方法的生物芯片相连。可将连接生物芯片的核酸探针设计为基本上与特异性表达的HVI标记核酸，即靶序列(无论是样品的靶序列还是其它探针序列，例如夹心测定中的序列)互补，从而使得靶序列与本发明的探针杂交。此互补性无需完美；靶序列与本发明的核酸探针之间可存在一定数量的干扰杂交的碱基对错配。然而，如果错配的数量太大以致于即使在最低严谨性杂交条件下也不发生杂交，则该序列不是靶序列的互补序列。在某些实施方案中，每条序列可利用多种探针，可利用重叠的探针或针对靶序列不同部分的探针。即，可用两种、三种、四种以上的探针(优选三种)构建具体靶(序列)而具有丰余度。这些探针可以是重叠的(即某些序列相同)或分离的。

本领域普通技术人员应该知道，可以各种方式将核酸连接于或固定于固体支持物。本文的“固定的”或其语法等价词表示核酸探针与固体支持物之间的连接或结合在下述结合、洗涤、分析和去除条件下足够稳定。结合可以是共价或非共价。本文的“非共价结合”与其语法等价词表示静电、亲水性和疏水性相互作用的一种或多种。非共价结合包括分子，例如链霉亲和素与支持物的共价连接与生物素化探针与链霉亲和素的非共价结合。本文的“共价结合”及其语法等价词表示两部分，即固体支持物与探针至少通过一根键，包括σ键、π键和配位键相连。探针与固体支持物之间可直接形成共价键，或者可通过交联接头或通过固体支持物或探针二者或此两种分子所含的特异性反应活性基团来形成共价键。固定化也可包括联合用共价和非共价相互作用。

总之，本领域技术人员知道可以各种方式连接探针与生物芯片。如本文所述，可先合成核酸，然后与生物芯片相连，或者可直接在生物芯片上合成核酸。

生物芯片包含合适的固体或半固体基板或固体支持物。“基板”或“固体支持物”表示经修饰而含有适合与核酸探针相连或结合的不连续多个位点并适用于至少一种检测方法的任何材料。本领域技术人员知道可用的基板很多，包括但不限于：玻璃与改性或功能化玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯与苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon^TM等)，多糖，尼龙或硝酸纤维素，树脂，二氧化硅或含硅材料(包括修饰的硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料等。总之，这些基板可用光学方法检测并且不带荧光。

所述基板一般是平的，虽然本领域技术人员知道也可利用其它构型的基板。例如，为对流过的样品进行分析而尽可能降低样品体积，可将探针置于试管的内表面。类似地，所述基板可以是可弯曲的，例如可弯曲的泡沫塑料，包括特定塑料制成的有密封小室的泡沫塑料。

在某些实施方案中，本领域已知可在基板上合成寡核苷酸探针。例如，利用光聚合化合物和技术的光活化技术。在一示范性例子中，采用熟知的光版印刷技术，例如WO 95/25116；WO 95/35505；美国专利号5,700,637和5,445,934及其引用的参考文献中所述的技术原位合成核酸；这些连接方法构成Affymetrix GeneChip^TM技术的基础。

在一示范性生物芯片分析的例子中，使生物芯片上的寡核苷酸探针在有助于特异性杂交的条件下与怀疑含有一种或多种疱疹病毒多核苷酸的核酸样品接触。可从生物材料的悬液中制备样品的DNA或RNA提取物(无论单链或双链)，或者研碎生物材料，或者按照细胞裂解步骤制备，所述步骤包括但不限于：用SDS(或其它洗涤剂)、渗透压冲击、异硫氰酸胍和溶菌酶处理进行裂解。可用于本发明方法的合适DNA包括cDNA。可采用多种常用方法之一制备这种DNA，例如见Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。

可用于本发明方法的合适RNA包括信使RNA、DNA转录的互补RNA(cRNA)或基因组RNA或次基因组RNA。可采用标准方法制备这种RNA，例如Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。

可通过，例如超声波处理或用限制性核酸内切酶处理使cDNA片段化。优选使cDNA片段化从而使产生的DNA片段长于固定的寡核苷酸探针，但足够小而可在合适的杂交条件下快速接触固定的探针。或者，可采用例如上述合适的核苷酸扩增技术来选择并扩增cDNA片段，这涉及利用合适的随机或特异性引物。

通常可检测性标记靶HVI标记多核苷酸从而可测定它们与各探针的杂交。通常用报导分子可检测性标记靶多核苷酸，所述报导分子的示范性例子包括色原、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、生物发光分子、镧系离子(例如，Eu³⁴)、放射性同位素和可直接观察的标记物。对于可直接观察的标记物，可利用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它载体等。此类的示范性标记物包括大的胶体，例如金属胶体，如金、硒、银、锡和钛氧化物胶体。在一些将酶用作可直接观察标记物的实施方案中，将生物素化的碱基掺入靶多核苷酸中。通过与链霉亲和素-报导分子培育来检测杂交。

合适的荧光染料包括但不限于：异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和得克萨斯红(Texas Red)。其它示范性荧光染料包括Dower等(国际公布WO 93/06121)中所述的。荧光染料也可参考美国专利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)。或者，荧光染料可参考美国专利号5,227,487；5,274,113；5,405,975；5,433,896；5,442,045；5,451,663；5,453,517；5,459,276；5,516,864；5,648,270和5,723,218中所述。可购得的荧光标记物包括，例如荧光素亚磷酰胺，如Fluoreprime^TM(Pharmacia)、Fluoredite^TM(Millipore)和FAM(Applied Biosystems International)。

放射性报导分子包括，例如可通过X-射线或磷酸成像(phosphoimager)技术检测的32P。

可在适合于寡核苷酸探针与测试核酸(包括DNA或RNA)杂交的条件下进行杂交形成步骤。就此而言，可参考例如《核酸杂交，一种实用方法》(NUCLEICACID HYBRIDIZATION，A PRACTICAL APPROACH)，(Homes和Higgins编)，(IRL press，Washington D.C.，1985)。总之，杂交是否发生受寡核苷酸探针和所测试多核苷酸序列的长度、pH、温度、一价和二价阳离子的浓度、杂交形成区中G和C核苷酸的比例、介质粘度和可能存在的变性剂的影响。这些可变因素也影响杂交所需时间。因此，优选的条件取决于具体应用。然而，可用常规方法确定这些经验性条件而无需过多实验。

某些优选实施方案采用高度鉴别性杂交条件。例如，可参考Wallace等(1979，Nucl.Acids Res.，6：3543)，他描述了与含有一个内部碱基对错配的相似寡核苷酸探针相比，可区别与靶序列完美匹配和完全同源的11-17个碱基长的寡核苷酸探针的杂交条件。也可参考Wood等(1985，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，82：1585)，他描述了利用3M氯化四甲铵使11-20个碱基长的寡核苷酸杂交的条件，其中杂交体的解链温度只取决于寡核苷酸探针的长度，而无论其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10个核苷酸长的寡聚物的严谨杂交条件，利用核苷酸类似物，例如“锁定核酸”不难获得相似条件(Christensen等，2001，Biochem J，354：481-4)。

杂交反应一般可在杂交缓冲液存在下进行，所述缓冲液任选含有杂交优化试剂，例如稳定剂(isostabilising agent)、变性剂和/或复性加速剂。稳定剂的例子包括但不限于：甜菜碱和低级四烷基铵盐。变性剂是通过干扰双链核酸碱基之间的氢键或核酸分子的水合作用来降低双链核酸分子解链温度的组合物。变性剂包括但不限于：甲酰胺、甲醛、二甲基亚砜、四乙基乙酸酯(tetraethylacetate)、脲、异硫氰酸胍(guanidium isothiocyanate)、甘油和离液盐。杂交加速剂包括核内不均一核糖蛋白(hnRP)A1和阳离子洗涤剂，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、聚赖氨酸、精胺、亚精胺、单链结合蛋白(SSB)、噬菌体T4基因32蛋白与乙酸铵和乙醇的混合物。杂交缓冲液可含有浓度为约0.005-约50nM、优选约0.5-5nM、更优选约1-2nM的靶多核苷酸。

使含有靶HVI标记多核苷酸的杂交混合物与探针阵列接触并在室温培育适当时间以使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针杂交。可在任何合适的容器中进行接触，例如设计用于盛放其上连接有探针的固体支持物的碟或小室。培育温度通常为核酸杂交所用的温度，例如约20℃-约75℃、如约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃，或约65℃。长度超过14个核苷酸的探针优选20-50℃。对较短的探针而言，优选较低温度。将靶多核苷酸样品与探针培育足够时间使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针之间达到所需杂交水平。例如，可在约45℃+/-10℃在甲酰胺中杂交1-2天。

杂交物形成步骤后，用含有与杂交步骤所用相同浓度的杂交优化剂的杂交缓冲液洗涤探针以除去任何未结合的核酸。此洗涤步骤只留下结合的靶多核苷酸。然后可检测探针以鉴定哪种探针与靶多核苷酸杂交。

然后可检测杂交反应以确定哪种探针与相应的靶序列杂交。取决于和靶多核苷酸连接的报导分子的性质，可通过以下方式用仪器检测信号：用光照射荧光标记物，用荧光计检测荧光；提供酶系统以产生可用分光光度计检测的颜色；或者用光反射仪检测染料颗粒或有色的胶体金属颗粒或非金属颗粒；用放射性标记物或化学发光分子时采用辐射计数器或放射自显影术。因此，检测装置应适用于检测或扫描标记物相关的光，所述光可包括荧光、冷光、聚焦光束或激光。此时，可用电荷耦合器件(CCD)或光电池来扫描微阵列中各位置探针：靶多核苷酸杂交物发射的光并直接在数字计算机上记录数据。在一些情况中，无需电子检测信号。例如，以酶促产生与核酸阵列模式相关的颜色斑点为例，目测该阵列就可解释阵列上的模式。在核酸阵列情况中，检测装置优选与模式识别软件相连而将阵列的信号模式转化为普通语言遗传分布模式。在某些实施方案中，不同HVI应激标记基因产物的特异性寡核苷酸探针采取核酸阵列形式，用“芯片阅读器”检测阵列上报导分子所产生的信号。“芯片阅读器”采用的检测系统如Pirrung等(美国专利号5,143,854)所述。芯片阅读器通常也包括一些信号加工过程来确定某具体阵列位置或元件处的信号是真阳性或者可能是假信号。示范性芯片阅读器例如Fodor等(美国专利号5,925,525)所述。或者，当阵列是由各种可寻址型标记的微珠混合物制成时，可采用流式细胞术检测该反应。

5.2蛋白质诊断

与本发明一致的是，存在异常浓度的HVI标记蛋白质表明疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染的存在、程度或阶段，或发生疱疹病毒感染后遗症的风险。可采用本领域已知的任何合适方法检测生物学样品中HVI标记蛋白质的水平。例如，当HVI标记蛋白质是酶时，可根据其催化活性或根据样品所含该蛋白质分子数来定量测定该蛋白质。可采用抗体技术，例如免疫组织学和免疫组织化学方法来检测组织样品中感兴趣蛋白质的水平。例如，用一抗(多克隆或单克隆)提供特异性识别，用第二检测系统检测一抗的存在(或结合)。可将可检测标记物，例如荧光标记物、放射性标记物或能产生可定量测定(如有色的)产物的酶(如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)与二抗相偶联。在另一合适的方法中，可检测性地标记一抗本身。因此可对组织切片作免疫组织学标记。在一些实施方案中，从生物学样品(例如，组织、细胞)中制备分析用蛋白提取物。可采用常规免疫印迹方法(Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.，101：976-985；Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.，105：3087-3096)经western-印迹或斑点/狭线实验(分析)这种提取物(例如，洗涤剂提取物)中感兴趣蛋白质的水平。

其它有用的抗体方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。例如，蛋白质特异性单克隆抗体可用作免疫吸附剂与酶标记探针来检测和定量测定感兴趣的HVI标记蛋白质。可采用线性回归计算机算法(参见，Lacobilli等，1988，Breast Cancer Research and Treatment，11：19-30)，参考标准制品中的含量来计算样品中这种蛋白质的含量。其它实施方案可用感兴趣蛋白质的两种不同单克隆抗体，一种作为免疫吸附剂，另一种作为酶标记探针。

此外，蛋白质捕获阵列领域的最新进展使得能同时检测和/或定量测定大量蛋白质。例如，滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用蛋白质阵列系统(Ge，2000，Nucleic Acids Res.，28(2)：e3)采用标准ELISA技术和扫描电荷耦联器件(CCD)检测器拍摄组成阵列的抗原图像。也开发了能同时检测临床(多种)分析物的免疫传感器阵列。目前已能用蛋白质阵列来分析体液中，例如健康或患病对象以及药物治疗前后对象血清中的蛋白质表达分布模式。

蛋白质捕获阵列一般包含多种蛋白质捕获剂，它们各自组成了该阵列空间位置不同的元件。蛋白质捕获剂可以是能结合蛋白质并将其固定在阵列上的蛋白质捕获剂位点的任何分子或分子复合物。蛋白质捕获剂可以是一种蛋白质，其在细胞中的天然功能是特异性结合另一种蛋白质，例如抗体或受体。或者，蛋白质捕获剂可以是能特异性结合某蛋白质的部分合成或全合成或重组的蛋白质。或者，蛋白质捕获剂可以是在体外根据对特异性靶蛋白质或肽的结合亲和力从诱变、随机或完全随机化与合成文库中选出的蛋白质。所用的选择方法可以任选是本领域已知的展示方法，例如核糖体展示或噬菌体展示方法。或者，经体外选择得到的蛋白质捕获剂可以是能特异性结合靶蛋白质的DNA或RNA适体(参见，例如Potyrailo等，1998，Anal.Chem.，70：3419-3425；Cohen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：14272-14277；Fukuda等，1997，Nucleic Acids Symp.Ser.，37：237-238；得自SomaLogic)。例如，用SelexTM方法从寡核苷酸文库中选择适体，可通过共价连接，例如掺入溴化脱氧尿苷和紫外光活化交联(光适体)来提高它们与蛋白质的相互作用。适体的优点在于易于通过自动寡核苷酸合成来制备，和DNA稳定而牢固；可采用通用荧光蛋白质染色技术来检测结合情况。或者，体外选择的蛋白质捕获剂可以是多肽(例如，抗原)(参见，例如Roberts和Szostak，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12297-12302)。

捕获分子的另一种阵列是通过“分子印刷”技术制成的阵列，其中的肽(例如蛋白质的C-末端区域)用作模板在可聚合基质中产生结构互补的序列特异性空隙；然后这些空隙能特异性捕获具有相应一级氨基酸序列的(变性的)蛋白质(例如，得自ProteinPrint^TM和Aspira Biosystems)。

示范性蛋白质捕获阵列包括通常称为抗体阵列的含有空间上可寻址的抗原结合分子的阵列，该阵列有助于大规模地平行分析众多蛋白质来确定蛋白质组或蛋白质亚组。抗体阵列显示具有所需的特异性性质和可接受的背景，一些阵列可购得(例如，BD Biosciences，Clontech，BioRad和Sigma)。制备抗体阵列的各种方法已有报道(参见，例如Lopez等，2003，J.Chromatogr.B，787：19-27；Cahill，2000，Trends in Biotechnology，7：47-51；美国专利申请公布2002/0055186；美国专利申请公布2003/0003599；PCT公布WO03/062444；PCT公布WO 03/077851；PCT公布WO 02/59601；PCT公布WO02/39120；PCT公布WO 01/79849；PCT公布WO 99/39210)。这些阵列的抗原结合分子至少可识别某细胞或细胞群所表达蛋白质亚组，其示范性例子包括生长因子受体、激素受体、神经递质受体、儿茶酚胺受体、氨基酸衍生物受体、细胞因子受体、胞外基质受体、抗体、凝集素、细胞因子、丝抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-样GTP酶、水解酶、类固醇激素受体、转录因子、热激转录因子、DNA-结合蛋白、锌指蛋白、亮氨酸拉链蛋白、同源域蛋白、胞内信号转导调节剂和效应物、凋亡相关因子、DNA合成因子、DNA修复因子、DNA重组因子、细胞表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。

在噬菌体展示或核糖体展示文库(例如，得自Cambridge AntibodyTechnology，BioInvent，Affitech和Biosite)中选择后可通过常规免疫方法(例如，多克隆血清和杂交瘤)，或作为通常在大肠杆菌中表达的重组片段制备抗体阵列的抗原结合分子。或者，制备的含非共价缔合的VH和VL结构域的“组合抗体(combibody)”形式为产生双抗体细菌克隆(例如，得自Domantis)组合所形成的矩阵。用作蛋白质捕获剂的示范性抗原结合分子包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fv、Fab、Fab′和F(ab′)₂免疫球蛋白片段、合成的稳定Fv片段(如单链Fv片段(scFv)、通过二硫键稳定的Fv片段(dsFv))、单可变区结构域(dAbs)小抗体(minibody)、组合抗体和多价抗体(如双抗体和多-scFv)、骆驼(camelids)的单结构域或工程改造的人等价抗体。

空间位置不同的各蛋白质捕获剂通常连接于一般是平的或有起伏的支持物表面。常用的物理支持物包括载玻片、硅、微孔、硝酸纤维素或PVDF膜与磁性微珠和其它微珠。

虽然广泛采用将蛋白质微滴递送到平面上，但也可采用有关的其它构造，包括工具微流体学进展开发的CD离心装置(例如，购自Gyros)和专门化的芯片设计，例如平面中工程改造的微通道(例如，The Living Chip^TM，购自Biotrove)和硅表面的微小3D柱(例如，得自Zyomyx)。

也可将悬浮液中的颗粒用作阵列的基础，只要给它们的身份编码；这些系统包括用颜色编码的微珠(例如，购自Luminex、Bio-Rad和NanomicsBiosystems)、半导体纳米晶体(例如，Qdots^TM，购自Quantum Dots)、棒形编码珠(UltraPlex^TM，购自Smartbeads)和多金属微杆(Nanobarcodes^TM颗粒，购自Surromed)。也可将这些珠在半导体芯片上组装成平面阵列(例如，购自LEAPS technology和BioArray Solutions)。当用颗粒时，各蛋白质捕获剂通常连接于各颗粒以提供空间确定位置或分开的阵列。然后分别(但平行)以隔离方式，例如在微滴定板的孔中或不同试管中检测这些颗粒。

在操作中，将蛋白质样品任选片段化以形成肽片段(参见，例如美国专利申请公布2002/0055186)，在适合于蛋白质或肽结合的条件下递送到蛋白质捕获阵列；洗涤该阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上洗去。然后，利用合适的检测系统检测与阵列上各元件结合的蛋白质或肽的存在或含量。将与阵列上某元件结合的蛋白质测定量与该阵列第二元件结合的第二蛋白质的含量作比较。在某些实施方案中，样品中第二蛋白质的含量是已知或已知不变。

为分析两种细胞或细胞群之间蛋白质表达的差异，将第一种细胞或细胞群的蛋白质样品在适合于蛋白质结合的条件下递送到该阵列。将第二种细胞或细胞群的蛋白质样品以类似方式递送到与第一阵列相同的第二阵列。然后洗涤两阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上洗去。最后，将维持与第一阵列元件结合的蛋白质含量和维持与第二阵列的相应元件结合的蛋白质含量作比较。为测定两种细胞或细胞群之间蛋白质表达模式的差异，将与第一阵列各元件结合的蛋白质含量从与第二阵列的相应元件结合的蛋白质含量中扣除。

在一示范性例子中，可利用荧光标记检测与阵列结合的蛋白质。将与解读DNA微阵列所用相同的仪器应用于蛋白质捕获阵列。为展示差别，可用得自两种不同状态细胞的荧光标记蛋白质检测捕获阵列(例如，抗体阵列)，两种状态的细胞裂解物用不同荧光团(例如，Cy-3和Cy-5)标记并混合，从而可将颜色作为靶(分子)丰度变化的读数。通过酪酰胺信号扩增(TSA)(例如，购自PerkinElmer Lifesciences)可将荧光读数灵敏度提高10-100倍。平面波导技术(例如，购自Zeptosens)能进行超灵敏的荧光检测，其另一优点是无需洗涤。利用藻红蛋白作标记物(例如，购自Luminex)或利用半导体纳米晶体(例如，购自Quantum Dot)性能的悬浮珠和颗粒也能实现高灵敏度。已采纳荧光共振能量转移来检测可用于阵列的未标记配体的结合(例如，购自Affibody)。已开发了几种其它读数装置，包括以下方法的改进装置：表面等离振子共振(例如，购自HTS Biosystems和Intrinsic Bioprobes)、滚动循环DNA扩增(例如，购自Molecular Staging)、质谱(例如，购自Sense Proteomic，Ciphergen，Intrinsic和Bioprobes)、共振光散射(例如，购自Genicon Sciences)和原子力显微镜(例如，购自BioForce Laboratories)。NextGen和PerkinElmer Life Sciences共同开发了用于样品与载玻片阵列自动培育和洗涤的微流体系统。

在某些实施方案中，用于检测HVI标记表达产物的技术包括用内部或外部标准品来定量或半定量测定那些产物，从而能有效地比较生物学样品中这些表达产物与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性。技术人员采用标准方法可以确定这种标准品。具体实施例中测定了各表达产物的水平或功能活性的绝对值。

在特定的实施方案中，可利用如国际公布号WO 02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申请号PCT/AU03/01517中所述的，包括与基站相耦联的至少一个终端站的系统来执行此诊断方法。基站通常与一个或多个数据库相耦联，这些数据库含有大量个体的代表HVI标记表达产物水平或功能活性的预定数据，以及收集这些预定数据时这些个体实际状态的指征(例如，疱疹病毒感染的存在、不存在、程度、阶段或发生疱疹病毒后遗症的风险)。在操作中，基站一般通过通信网络接受终端站的数据并将所述数据与存储在数据库中的预定数据作比较，所述数据代表对应于取自测试对象生物学样品中至少一种表达产物所检测到或标准化的水平或功能活性。将该对象的数据与预定数据作比较使基站能根据比较结果确定该对象的状态。因此，基站试图鉴定与测试对象具有相似参数值的个体，一旦根据该鉴定(结果)确定了状态，基站会将显示的诊断送至终端站。

5.3试剂盒

可将检测与定量测定HVI标记基因表达产物所需的所有必需材料和试剂一起组装在试剂盒中。这些试剂盒也任选装有检测标记物的合适试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微滴定板稀释缓冲液等。例如，核酸检测试剂盒可装有(i)HVI标记多核苷酸(可用作阳性对照)，(ii)能与某种HVI标记多核苷酸特异性杂交的引物或探针。也可装有适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶，Taq，Sequenase^TM DNA连接酶等，取决于所采用的核酸扩增技术)，脱氧核苷酸和缓冲液以提供扩增所需的反应混合物。这种试剂盒一般以合适方式装有各种试剂和酶以及各种引物或探针的不同容器。或者，蛋白质检测试剂盒可装有：(i)HVI标记多肽(可用作阳性对照)，(ii)能与某HVI标记多核苷酸发生免疫相互作用的抗原结合分子。该试剂盒的特征也在于装有进行本文所述试验的各种装置和试剂；和/或用该试剂盒定量测定HVI标记基因表达的印制的使用说明书。

这些试剂盒任选装有检测标记物的合适试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微滴定板稀释缓冲液等。例如，核酸检测试剂盒可装有(i)HVI标记多核苷酸(可用作阳性对照)，(ii)能与某种HVI标记多核苷酸特异性杂交的引物或探针。也可装有适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶，Taq，Sequenase^TM DNA连接酶等，取决于所采用的核酸扩增技术)，脱氧核苷酸和缓冲液以提供扩增所需的反应混合物。这种试剂盒一般以合适方式装有各种试剂和酶以及各种引物或探针的不同容器。或者，蛋白质检测试剂盒可装有：(i)HVI标记多肽(可用作阳性对照)，(ii)能与某HVI标记多核苷酸发生免疫相互作用的抗原结合分子。该试剂盒的特征也在于装有进行本文所述试验的各种装置和试剂；和/或用该试剂盒定量测定HVI标记多核苷酸表达的印制的使用说明书。

6.治疗或预防方法

在作出对象有发生疱疹病毒感染后遗症风险阳性诊断后，本发明也可延伸用于治疗或预防对象的疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染。总体上，所述治疗包括给予诊断阳性的对象有效量的药物或治疗以改善症状或逆转疱疹病毒感染的发生，或降低对象发生疱疹病毒感染后遗症的可能性。目前适用于治疗疱疹病毒感染的药物包括但不限于：例如美国专利申请公布号20020147210所述的阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、叠氮胸苷、胞苷阿糖苷、利巴韦林、金刚烷胺、碘代脱氧尿苷、poscarnet、trifluoridine、美替沙腙(methizazone)、阿糖腺苷、levanisole 4-氨基-α，α-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑(imidazo)[4，5-c]喹啉-1-乙醇；美国专利申请公布号20020103262所述的羟化二苯乙炔；美国专利号5,840,728所述的环丙基化(cyclopropanated)碳环2′-脱氧核苷；美国专利号6,048,843所述的胸腺嘧啶-类似物抗疱疹药物；美国专利申请公布号20040053891所述的膦甲酸(PFA，产自Astra，Sodertlje，瑞典的Foscavir^TM)、5-(E)-溴乙烯基尿嘧啶类似物与相关的嘧啶核苷；美国专利申请公布号20040024209所述的1-芳基-4-氧-1，4-二氢-3-喹啉羧酰胺；与Raymond等，(1984，Biochem.Bioph.Res.Comm.，121(3)：848-854)所述的亚精胺儿茶酚酰胺铁螯合剂。

或者，可利用如美国专利申请公布号20020099426所述的装置治疗对象，所述装置将电刺激递送给患者受感染的皮肤或粘膜。以具有不同电特征的一系列电脉冲施加电刺激。

然而，应该知道本发明包括可用于治疗或预防疱疹病毒感染的任何药物或方法，并不限于上述的示范性化合物和制剂。

疱疹病毒缓解药物一般与药学上可接受的载体组成药物(或兽医学)组合物，以有效量给予来实现它们所需的目的。给予对象的活性化合物的剂量应在一段时间内足以在对象中引发有益反应，例如降低或减轻疱疹病毒感染，特别是活动性疱疹病毒感染的症状。给予的药学活性化合物的用量取决于待治疗的对象，包括其年龄、性别、体重和全身健康状况。就此而言，所给予的活性化合物的精确用量取决于从业医师的判断。在确定给予治疗或预防疱疹病毒感染的活性化合物的有效量时，医师或兽医应评估与疱疹病毒感染存在相关症状的严重性，包括上述疱疹病毒感染后遗症相关症状。在任何情况中，本领域技术人员不难确定疱疹病毒感染缓解药物的合适剂量与合适的治疗方案而无需过多实验。

在特定的实施方案中，在诊断阳性对象存在EHV或其阶段后，本发明可延伸用于治疗EHV感染、治疗EHV感染复发或预防对象进一步被EHV感染。总体上，治疗包括隔离以防进一步感染，姑息剂治疗与休息以避免长时期损伤。本发明在动物是传染性时可作出更有效的隔离与控制决定，知道这种信息的兽医、马主人与训练员就能将这些动物隔离直至病毒扩散终止从而防止感染其它马匹，特别是其它妊娠母马。相反，现有方法只能在传染阶段经过后才能诊断EHV，因此不能用于隔离决定。

为便于理解和实施本发明，通过以下非限制性实施例描述了特别优选的实施方案。

                          实施例

                          实施例1

               鉴定疱疹病毒感染的特异性诊断基因

                 实验性疾病试验设计

在不同时间，在两组13匹幼驹中诱导马疱疹病毒1(EHV-1)感染。6匹幼驹跟踪观察20天(组1)，在第0天感染(实验性接种)。7匹幼驹跟踪观察42天(组2)，在第21天感染(实验性接种)。用体外培养的EHV-1鼻咽气溶胶感染所有幼驹。组1的血液样品在第0、1、2、4、6、10、13和20天的8个时间点采集。组2的血液样品在第0、1、2、4、6、10、13、20、21、22、23、25、27、31、34和41天的16个时间点采集。第0天的样品用作各匹马的对照。

然后发现组2的动物已受到EHV的天然且不同步的感染。组2的所有动物血清阳转，利用血清阳转时间估算天然感染的时间(约在血清阳转前10-14天)。由于组2的感染时间不同步，利用这些动物的基因表达数据来检验利用组1得到的诊断特征。

在所有时间点进行以下检验与观察：

●体检，包括体温、脉搏与呼吸测量

●血液学与生物化学(检验)

●对鼻拭子进行PCR

●血清EHV-1抗体(Ab)滴度

●对白细胞特异性基因阵列进行基因表达分析。

利用含有马白细胞所表达的数千种基因的GeneChips^TM(使用方法详述于下文“产生基因表达数据”)分析取自受感染动物的血液样品。分析这些数据(参见下文“鉴定应答基因与证明诊断潜力”)揭示感染EHV前后与感染后第一天之间动物的许多基因表达有差异。可以设计一种试验检测样品中至少一种，优选至少两种HVI标记基因的RNA水平，所述基因的代表性转录序列如下所示：1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113。此方法的特异性和灵敏度水平均为94％。或者，至少两种多核苷酸与表1所列其它61种HVI标记多核苷酸之一的任何组合均具有强有力的诊断能力。

                      材料与方法

                         采血

从马匹(非激动状态)采血提取高质量的RNA或蛋白质。收集、保藏、转运和分离RNA的合适采血试管包括PAXgene^TM试管(PreAnalytix Inc.，Valencia，CA，美国)。或者，可将血液收集入含有设计用于保藏核酸的溶液(购自Roche，Ambion，Invitrogen和ABI)的试管中。为测定蛋白质水平，将50ml血液收集入含有4ml 4％柠檬酸钠的试管中以防凝结。分离白细胞和血浆，冷冻保藏用于随后分析与检测特异性蛋白质。将PAXgene试管保持于室温，然后提取RNA。以标准格式记录临床体征。

Qiagen Inc(Valencia，CA，美国)的试剂盒装有收集的2.5mL血液的PAXgene血液RNA试管(PAXgene Blood RNA Tube)的和分离总RNA的试剂和使用说明书。分离从离心步骤开始沉淀PAXgene血液RNA试管中的核酸。洗涤沉淀物，重悬，用含有蛋白酶K的优化缓冲液培育以消化蛋白质。再次离心除去残留的细胞碎片，将上清液转移至新鲜的微离心管中。加入乙醇调节结合条件，将裂解物施加于PAXgene RNA自旋(spin)柱上。在简单离心期间，RNA选择性地与硅胶膜结合，而污染物流出。经三次有效洗涤步骤除去残留的污染物，然后用缓冲液BR5洗脱RNA。

测试前需要用Agilent生物分析仪和分光光度计以吸光度260/280比值定量和定性测定RNA。

                           DNA提取

Qiagen Inc(Valencia，CA，USA)的试剂盒装有收集的8.5ml血液的PAXgene血液DNA试管(PAXgene Blood DNA Tube)和分离总DNA的试剂和使用说明书。分离开始加入额外的裂解溶液然后离心。洗涤沉淀物、重悬，用含有蛋白酶K的优化缓冲液培育以消化蛋白质。乙醇沉淀DNA，再离心一次沉淀核酸。洗涤除去残留污染物，然后将DNA重悬于缓冲液BG4中。

测试前需要用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳定量和定性测定DNA。

                          血清抗体测定

基本上如Foote等，(Equine Vet J.，36(4)：341-345，2004)所述，用重组EHV-1糖蛋白G通过ELISA测定EHV-1的血清抗体水平。总RNA提取。

                       产生基因表达数据

                           方法选择

可采用各种技术检测组织样品中的特异性RNA水平。本领域熟知的两种常规且易于使用的技术是：

采用Affymetrix技术作GeneChip^TM分析；

实时聚合酶链式反应(例如，Applied Biosystems的TaqMan^TM)。

GeneChips^TM通过检测与构建在硅基板上的短寡核苷酸杂交的标记cRNA来定量测定RNA。该技术和方法详见www.affymetrix.com。

实时聚合酶链式反应(RT-PCR)利用两种PCR引物、标记的探针和热稳定DNA聚合酶来定量测定RNA。PCR产物产生的颜色释放入溶液，检测该颜色。常用内部对照，例如18S RNA探针测定样品中总RNA的起始水平。分别测定各基因与内部对照。该技术和方法详见www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.com或www.biorad..com。AppliedBiosystems提供以下服务：即客户提供DNA序列信息并负费，作为回馈该公司提供对各基因进行RT-PCR所需的全部试剂。

GeneChip^TM分析的优点是一次能分析数千个基因。然而，该分析昂贵且进行一次试验要3天以上。RT-PCR一般一次只能分析一种基因，但廉价并且能在一天内完成。

如果待分析的具体基因数目少于20，则RT-PCR是可选的基因表达分析方法。当需要同时分析许多基因时，GeneChip^TM或其它基因表达分析技术(例如Illumina珠阵列)是可选的方法。

用于产生和分析GeneChip^TM数据的方法与实时PCR概述于下文。

                  产生GeneChip^TM数据

制备cDNA和cRNA

从总RNA制备cDNA和cRNA的以下方法采用Affymetrix(www.affymetrix.com)提供和推荐的方法。

步骤是：

●总共3μg的总RNA用作模板来制备双链cDNA。

●制备cRNA并用生物素化尿嘧啶(dUTP)作标记。

●纯化(clean)生物素作标记的cRNA，利用分光光度计和MOPS凝胶分析定量测定。

●将作标记的cRNA片段化为约300bp大小。

●利用Agilent“Lab-on-a-Chip”系统(Agilent Technologies)测定RNA含量。

杂交、洗涤和染色

步骤是：

●制备含有0.05μg/μL作标记和片段化的cRNA、掺杂(spike-in)阳性杂交对照和Affymetrix寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的杂交混合物。

●将终体积(80μL)的杂交混合物加入GeneChip^TM药盒中。

●将该药盒置于恒定转速的杂交炉中，16小时。

●去除GeneChip^TM中的液体并保存。

●将GeneChip^TM置于流体站中。

●将各GeneChip^TM的实验条件记录为.EXP文件。

●助理人员加入合适的溶液后，Affymetrix流体站执行所有的洗涤和染色过程。

●洗涤GeneChip^TM，用链霉亲和素-藻红蛋白染料染色，然后用低盐溶液再次洗涤。

●洗涤完成后，用激光“激发”探针阵列上的染料，用Affymetrix扫描仪(Agilent制造)通过CCD照相机拍摄图像。

扫描和产生数据文件

扫描仪和MAS 5软件产生一个GeneChip^TM的图像文件，称为.DAT文件(参见背面的图)。

预处理.DAT文件后进行统计学分析。

数据的预处理步骤(在任何统计学分析之前)包括：

●.DAT文件的质量控制(QC)。

●产生.CEL文件。

●标定(scaling)和标准化。

.DAT文件的质量控制

.DAT文件是一种图像。手工检查这些图像的人为因素(artifact)(例如，高/低强度斑点，划痕，高的局部背景或总背景)。(通过改变产生边界的强度模式和阵列名称不难鉴定B2寡核苷酸阵列的杂交性能)。MAS 5软件利用B2寡核苷酸边界来比对图像上的栅格从而可集中和鉴定各方格的寡核苷酸。

利用其它掺杂(spiked)杂交对照(bioB、bioC、bioD和cre)通过读取随信号值的增加反映它们相对浓度的“本”基因检测引入子程序来评估样品的杂交效率。(如果.DAT文件具有合适的质量，用Affymetrix MAS 5软件将其转化为强度数据文件(.CEL文件))。

产生.CEL文件

用MAS 5软件从.DAT文件产生的.CEL文件包含该探针组计算的原始强度。从各细胞(测定)值中扣除计算的背景值得到基因表达数据。为除去阴性强度值，应用了基于最低2％背景值的标准偏差的局部噪声值的噪声校正分式。

将GeneChip^TM产生的所有.CEL文件应用于特定的质量度量标准参数。

一些度量标准由Affymetrix常规推荐，可用作为GeneChip^TM的一部分而提供的Affymetrix内部对照测定。其它度量标准根据经验和许多GeneChip^TM的处理而定。

                   分析GeneChip ^TM数据

可用于数据标准化的三种示范性方法是：

●Affymetrix MAS 5算法。

●Irizarry的可靠多芯片分析(Robust Multi-chip Analysis)(RMA)算法(Irizarray等，2002，Biostatistics(印刷中))。

●可靠多芯片分析保留模型(Robust Multi-chip Analysis Saved model)(RMAS)

本领域技术人员应知道可采用许多其它方法而不会对本发明有实质影响。

                   Affymetrix MAS 5算法

Affymetrix MAS 5软件利用.CEL文件来标准化或标定数据。将一块芯片的标定数据与另一芯片的相似标定数据作比较。

对.CEL文件应用MAS 5算法的默认“全球定标(Global Scaling)”选项来实现Affymetrix MAS 5标准化。此法扣除了探针值分布中心的可靠估计值，再除以探针可变性的可靠估计值。这产生了在探针水平具有共同位置和标定的一组芯片。

通过对某给定基因的所有探针对可靠平均化方法得到基因表达指数。将结果强制为非阴性。

鉴于是在探针水平而不是在基因水平进行标定，故即使标准化后总体基因表达水平在芯片之间也可能存在差异。将标准MAS 5标准化后，根据芯片强度中值使各基因值去趋势(de-trend)。即，各基因值根据芯片强度中值回归，计算残差。取这些残差作为各基因表达去趋势的估计值。

用Affymetrix MAS5算法计算芯片中值强度，但标定因子固定是一。

                         RMA分析

除了用chip.cel文件的长期文库建立探针权重和靶分位数(quantile)，和不对这些特异性芯片再重复计算外，此方法与RMA方法相同。将探针水平再次进行标准化。

                     产生实时PCR数据

在例如http：//dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html和Bustin SA的综述(2000，J Mol Endocrinol，25：169-193)中可获得执行实时PCR的背景信息。

TaqMan^TM引物和探针设计指南：

1.Primer Express^TM(ABI)软件设计了解链温度(Tm)为58-60℃的引物和Tm值为10℃以上的探针。两种引物的Tm应该相同；

2.引物应长15-30个碱基；

3.G+C含量优选30-80％。如果G+C含量较高无法避免，则需要采用高退火和解链温度，用共溶剂，例如甘油、DMSO或7-脱氮杂-dGTP；

4.应避免成串的相同核苷酸。这对G而言尤其重要，不可以有4个以上的G串；

5.引物3’末端的最后5个核苷酸中G和C的总数应不超过2个(较新版本的该软件具有自动执行此功能的选项)。这有助于在引物的3’末端引入相对不稳定性从而减少非特异性致敏。引物条件与SYBR Green试验相同；

6.最大扩增子的长度不应超过400 bp(优选50-150个碱基)。较小的扩增子能得到更一致的结果，因为PCR更有效且对反应条件更耐受要求长度短与5′核酸酶活性的功能无关)；

7.该探针不应含有成串的相同核苷酸(特别是4个以上的连续G)，G+C含量应为30-80％，C应比G多，5′末端不应是G。C的数量越多，产生的ΔRn越高。应先选择探针；

8.为避免因扩增了cDNA制剂中污染性基因组DNA所致的假阳性，引物宜跨越外显子-外显子连接区。这样不会扩增基因组DNA(用于人GAPDH扩增的PDAR试剂盒装有这种引物)；

9.如果设计TaqMan^TM探针来区别等位基因，错配的核苷酸(多态性位点)应在探针中间而不是两端；

10.可利用3’末端附近含有dA核苷酸的引物通过AmpErase^TM UNG有效地降解所产生的任何引物二聚体(见EZ RT-PCR试剂盒手册的第9页；P/N 402877)。如果不能选择在二末端附近含有dA核苷酸的引物，则应考虑利用具有3′末端dU-核苷酸的引物。

(也可参见Invitrogen的《PCR引物设计》(PCR Primer Design)的通用原理)。

通用方法：

1.用随机六聚体(不含有寡聚-dT)将总RNA逆转录为cDNA。如果不得不用寡聚-dT，则应避免上游有两千碱基以上的长mRNA转录物或扩增子，18S RNA不能用作标准品；

2.多重PCR只在对照引物有限时可正确进行(ABI对照试剂不限制它们的引物)；

3.靶cDNA用量范围是10ng-1g。如果用DNA(主要用于等位基因鉴别研究)，最佳用量是100ng-1g；

4.最好用不含RNA酶的DNA酶处理各RNA制品以避免基因组DNA污染。即使是最佳的RNA提取方法也会产生一些基因组DNA。当然最好有根本不扩增基因组DNA的引物，但有时这做不到；

5.为得到最佳结果，试剂(在制备PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加样之前)应充分振荡(vortex)与混合。否则在PCR的早期轮次(0-5)中Rn值可能会有漂移。先将探针加入缓冲液组分使其在室温下平衡再配制试剂混合物也很重要。

TaqMan^TM引物和探针：

定购自ABI的中等规模(midi-scale)TaqMan^TM探针收到时是100μM的混悬液。如果制备1/20稀释液，则得到5μM溶液。此储备溶液应分为等份、冷冻、闭光保存。在50μL反应体积中其用量为1μL得到推荐的100nM终浓度。

引物收到时是冻干的，含量以pmol标在试管上(例如150.000pmol等于150nmol)。如果将X nmol的引物重悬在XμL水中，得到的溶液是1mM。最好将此储备液分成等份冷冻。当将1mM储备液稀释100倍时，得到的工作溶液是10μM。为使50μL反应体积中的最终引物浓度为推荐的50-900nM，每次反应使用0.25-4.50μL(500nM终浓度用2.5μL)。

PDAR引物和探针以保存于一个试管中的混合物提供。它们在50μL反应体积中用量为2.5μL。

设置一步TaqMan ^TM反应：

一步实时PCR将RNA(与cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液浓度低则优选此方法，但只在进行单重反应时。缺点是RNA遗留物使得酶AmpErase不能用于一步反应。在此方法中，逆转录和实时PCR发生在同一试管中。下游PCR引物也用作逆转录酶的引物(随机六聚体或寡聚-dT不能用于一步RT-PCR中的逆转录)。一步反应需要较高的dNTP浓度(大于或等于300mM与200mM)，因为该反应合并了需要dNTP的两种反应的一种。Gold RT-PCR试剂盒的一步PCR所用的典型反应混合物如下：

如果用PDAR，则用2.5μL的引物+探针混合物。

此反应优选用10pg-100ng RNA。注意将模板用量从100ng降低至50ng将使CT值增加1。为使CT值降低3，起始的模板用量应增加8倍。ABI宣称此系统可检测到2皮克的RNA，RNA的最大用量可以是1微克。为进行常规分析，可用10pg-100ng的RNA和100pg-1μg基因组DNA。

一步PCR的循环参数：

逆转录(MuLV)，48℃30分钟。

AmpliTaq活化，95℃10分钟。

PCR：95℃变性15秒，60℃退火/延伸1分钟(重复40次)(在ABI 7700上，最低维持时间是15秒)。

最新介绍的EZ one-step^TM RT-PCR试剂盒可利用UNG，因为利用了热稳定性逆转录酶使得逆转录的培育时间是60℃。此温度也是避免在48℃形成引物二聚体和非特异性结合的较好选择。

操作ABI 7700：

开始运行前应确认以下事项：

1.运行的循环参数正确；

2.光谱补偿的选择正确(单重反应选off，多重反应选on)；

3.Analysis Options box(分析选项框)(Analysis(分析)/Options(选项))中的“Number of PCR Stages(PCR阶段编号)”选择正确。如果扩增图中没有数据，但在平面图中可见，并且扩增(图)的X-轴显示范围0-1轮，则在运行一次后必须手动设定此(参数)。

4.模板对照(Template Control)不如此标记(为精确计算ΔRn)；

5.数据分析前应正确选择染料组分；

6.你必须在运行开始前给予名称(不能维持未命名)并保存；

7.在运行结束时，先保存数据再开始分析；

(使用)ABI软件需要极其谨慎。揿下Run(运行)按钮后不要试图停止运行。你有问题并如果需要开关机器时，必须等至少1小时才能重新启动运行。

当分析数据时，记住默认的基线设置是3-15。如果任何CT值＜15，应随之改变基线(基线停止值应比最小的CT值小1-2)。此问题的有用讨论见《ABI基线与阈值设置指南》(ABI Tutorial on Setting Baselines andThresholds)。(令人感兴趣的是，此问题的最佳讨论见TaqMan^TM人内源性对照板(Human Endogenous Control Plate)的手册中)。

如果结果没有意义，检查原始光谱看运行期间CDC照相机(是否)可能饱和。利用光学盖(optical cap)而不是光学粘性罩(optical adhesive cover)可防止CDC照相机饱和。当利用SYBR Green I、多重(反应)和高浓度探针时，更可能发生(CDC照相机饱和)。

结果解析：

每次反应结束时，所记录的荧光强度用于以下计算：

Rn⁺是含所有组分时反应的Rn值；Rn-是未反应样品的Rn值(基线值或NTC中检测的值)。ΔRn是Rn⁺与Rn-之间的差异。它是PCR产生的信号数量级指标。

定量测定模板含量有三种示范性方法：

1.绝对标准方法：在此方法中，用含量已知的标准品，例如体外翻译的RNA(cRNA)。

2.相对标准方法：每次运行的试验设计中包括已知量的靶核酸；

3.比较性CT方法：此方法不用含量已知的标准品，而是将靶序列的相对量与选择的任何参比值作比较，结果相对于参比值(例如静息淋巴细胞或标准细胞系的表达水平)给出的量。

基因表达相对定量测定的比较性CT方法(ΔΔCT)：

此方法在观察相对于活性参比对照物(标准品)的表达水平时无需制作标准曲线即能相对地定量测定模板并提高样品处理量。为成功实施此方法，应使靶标和参比物的动态范围相似。控制此(动态范围)的灵敏方法是观察ΔC_T(同一起始模板用量作两次PCR所得两个CT值之间的差异)如何随模板的稀释度而变化。如果两种扩增子的效率大致相等，将输入量的对数与ΔC_T作图得到接近水平的线(斜率＜0.10)。这表示在起始模板用量范围内进行的两次PCR效率相同。如果该图显示效率不相等，应采用标准曲线方法来定量测定基因表达。应测定(1)靶标结果的精确最低和最高浓度和(2)两种基因含量结果的精确最低和最高比例二者的动态范围。在常规竞争性RT-PCR中，该动态范围限制在靶标-竞争物比例约为10∶1-1∶10(1∶1的比例可获得最佳精确性)。实时PCR能实现更广泛的动态范围。

在不同试管中扩增靶标和内源对照物，采用标准曲线方法几乎不需要优化和验证。采用比较性CT方法的优点在于无需制作标准曲线(样品可利用更多的孔)。该方法也消除了制作标准曲线样品时可能产生的任何稀释误差的负面影响。

只要靶标和标准品具有相似的动态范围，比较性CT方法(ΔΔCT方法)是最实用的方法。预计标准品比靶标的表达水平高(因此，CT值较低)。从得到靶标和标准品的CT值间的差异(ΔCT)开始定量计算：

ΔCT＝CT(靶标)-CT(标准品)

计算待定量的各样品的此值(除非靶标的表达水平高于标准品，此值应为阳性值。如果是阴性也无害)。每次比较应选择这些样品之一作为参比品(基线)。比较性ΔΔCT计算包括找到各样品ΔCT与基线ΔCT之间的差异。如果基线值表示最低表达水平，则预计ΔΔCT值是阴性(因为基线样品的ΔCT因其具有最大CT值而是最大)。如果一些样品中表达增加，而另一些中减少，ΔΔCT值将是阴性和阳性数值的混合值。定量测定的最后一步是将这些数值转化为绝对值。此计算公式是：

比较性表达水平＝2-ΔΔCT

就表达而言，与基线水平相比，(样品)增加约23＝8倍，而降低约为参比品水平的2-3＝1/8。通过简单地输入CT值用微软Excel进行这些计算(ABI在http：//www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有关于利用扩展层程序(spread sheet program)来产生扩增图的在线指南；TaqMan^TM人内源性对照板(Human Endogenous Control Plate)方法也包括有关用MSExcel进行实时PCR数据分析的详细说明)。

其它(绝对)定量方法概述于ABI用户公告(http：//docs.appliedbiosystems.com/search.taf？_UserReference＝A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5对全面理解实时PCR和定量最有用。

推荐方法：

1.利用正位置换液管(positive-displacement pipette)以避免移液不精确；

2.实时PCR的灵敏度可检测出2pg总RNA中的靶标。反应所用总RNA的拷贝数最好应通过25-30轮即足以产生信号(优选低于100ng)。为实现此目的应降低或增加用量；

3.各试剂的最佳浓度如下；

i.氯化镁的浓度应是4-7mM。对用Primer Express software(引物表达软件)设计的引物/探针而言最佳是5.5mM；

ii.除dUTP外(如果使用的话)，各dNTP的浓度应平衡。用dUTP取代dTTP来控制PCR产物残留需要dUTP浓度是其它dNTP的两倍。虽然dNTP浓度的最佳范围是500μM-1mM(一步RT-PCR)，但典型的TaqMan反应(只是PCR)的各种dNTP采用200μM(400μM的dUTP)；

iii.通常向每50μL反应物中加入0.25μL(1.25 U)AmpliTaq DNA聚合酶(5.0U/μL)。这是最低要求。如果需要，可将此量增加0.25U达到最优；

iv.最佳探针浓度是50-200nM，引物浓度是100-900nM，应对三种不同温度(TaqMan引物的58、60和62℃)和三种浓度(50、300、900nM)的各种组合优化各对引物。这意味着设置了不同的三组(三种温度)，每组利用固定量的靶模板有九种反应(50/50mM、50/300mM、50/900、300/50、300/300、300/900、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(进行)第二轮优化来改善结果。选择可提供最低CT和最高ΔRn的引物浓度来实现最佳性能。类似地，应将探针浓度优化为25-225nM；

4.如果用AmpliTaq Gold DNA聚合酶，为实现此目的需要在PCR前于92-95℃加热9-12分钟。如果用AmpliTaq Gold DNA聚合酶，不需要在冰上反应。典型的TaqMan反应包括50℃UNG(参见下文)培育2分钟；95℃活化聚合酶10分钟；和95℃15秒(变性)40轮与60℃1分钟(退火与延伸)。如果起始材料是总RNA，在TaqMan反应之前通常应进行逆转录循环，该循环(cDNA合成)由25℃10分钟(引物培育)，48℃30分钟(用常规逆转录酶进行逆转录)和95℃5分钟(灭活逆转录酶)；

5.向该反应中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)来除去掺入扩增子中的任何尿嘧啶以防残留PCR产物再扩增。这是PCR反应中为何用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55℃以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的单链DNA。除非逆转录和PCR采用rTth DNA聚合酶，一步RT-PCR不应使用含UNG的主混合物(TaqMan EZ RT-PCR试剂盒)；

6.每块反应平板中必需包含至少三份非扩增对照(NAC)以及三份非模板对照(NTC)(为在确定的靶标扩增的+/-阈值中达到99.7％可信度水平，必须进行一式六份NTC)。NAC样板含有样品，不含酶。需要排除样品中或热循环仪的加热块(heating block)中荧光污染物的存在(这些污染物可导致假阳性)。如果PCR后NAC的绝对荧光大于NTC，样品中或热循环仪的加热块中可能存在荧光污染物。

7.如果要将ΔΔCT方法用于相对定量测定，应核查引物/探针系统及其标准品的动态范围。通过以5种RNA浓度(例如，0.80pg/μL、400pg/μL、2ng/μL和50ng/μL)进行(一式三份)反应来实现此核查。对于相同的总RNA浓度范围，进行靶标和标准品的实时RT-PCR得到的起始含量的对数与CT值作图(标准曲线)应该是(接近)直线；

8.被动参比物是加入反应中的染料(ROX)(存在于TaqMan通用PCR主混合物中)。它不参与5’核酸酶反应。它提供了背景发射荧光的内部参比物。可用其来标准化受体-染料信号。对孔与孔之间(浓度或体积差异)或随时间变化发生的非PCR相关荧光波动进行此标准化，不同于对cDNA用量或PCR效率进行的标准化。将报导染料的发射光强度除以被动参比物的发射光强度进行标准化。得到的比值定义为Rn；

9.如果进行多重(反应)，更丰富的靶标将在其它靶标得以扩增之前耗尽所有的反应成分。为避免此种情况，对更丰富的靶物质应限制其引物的浓度；

10.TaqMan通用PCR主混合物应保存于2-8℃(不是-20℃)；

11.用JOE报导染料标记TaqMan Gold RT-PCR试剂盒提供的GAPDH探针，用VIC标记Pre-Developed TaqMan^TM Assay Reagents(PDAR)试剂盒提供的同一探针。设计的这些人GAPDH试验的引物不会扩增基因组DNA；

12.为防止酶残留，需要48℃培育的一步RT-PCR法不能利用AmpErase UNG，但EZ RT-PCR试剂盒中可用；

13.单重反应只能用一步RT-PCR法，逆转录法只能选择下游引物(不是随机六聚体或寡聚-dT)；

14.优选进行一式两份(反应)来控制移液误差，但这不可避免会增加成本；

15.如果进行多重(反应)，在运行前应核查光谱补偿选项(在AdvancedOptions(高级选项)中)；

16.利用反应中的被动参比物(ROX)将荧光波动(值)标准化，和用内源性对照物(例如GAPDH，活性参比物)将cDNA/PCR用量的效率标准化是不同的方法；

17.ABI 7700不仅可用于定量RT-PCR也可用于终点PCR。后者包括存在/不存在试验或等位基因鉴别试验(例如SNP分型)；

18.PCR的前几轮(0-5轮)中Rn值漂移表示反应诸组分最初不平衡，但不影响最终结果，只要重新设置基线范围的下限值；

19.如果注意到扩增图异常(CT值＜15，在前几轮中检测到有扩增信号的轮次)，应降低基线范围的上限值，应稀释样品以提高CT值(污染也可能提高CT值)；

20.ΔRn值低(或高于预计的CT值)表明PCR效率不佳或者靶标的拷贝数低；

21.CT值的标准偏差＞0.16表明移液不精确；

22.纯色彩设置(Pure Dye Setup)中的SYBR绿色条目(SYBR Greenentry)以大写字母缩写为“SYBR”。任何其它缩写或小写字母会产生问题；

23.ABI 7700的SDS软件与8.1版的Macintosh操作系统有冲突。不应在这种计算机上分析数据。

24.ABI 7700不应长期停用。如果将其关闭，在运行前应预热至少1小时。推荐将仪器随时开着，这对激光有益。如果运行前刚开机，可能会出现显示操作系统版本冲突的出错框。如果发生此情况，选择“AutoDownload(自动下载)”选项。

25.ABI 7700只是可购得的实时PCR系统中的一种，其它包括BioRad、Cepheid、Corbett Research、Roche和Stratagene的系统。

                       基因型分析

许多方法可用于分析DNA的基因型。等位基因鉴别方法的综述见Kristensen等(Biotechniques，30(2)：318-322，(2001))。本文只描述了一种方法，等位基因特异性PCR法。

引物设计

可利用随意得到的计算机程序，例如Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3_code.html)来设计具体等位基因的特异性上游和下游PCR引物。或者，可利用诸如ClustalW(http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/)程序和针对存在DNA序列差异但保留足够特异性而能确保扩增正确的扩增子的区域设计的特异性引物来比对各等位基因的DNA序列。优选设计的PCR扩增子在一个等位基因中具有限制性酶切位点，而在其它等位基因中没有。引物通常长18-25个碱基对，具有相似的解链温度。

PCR扩增

对PCR反应组成的描述随处可见(《PCR的临床应用》(ClinicalApplications of PCR)，Dennis Lo(编)，Blackwell Publishing，1998)。简言之，此反应含有引物、DNA、缓冲液和热稳定性聚合酶。反应在热循环仪，例如PTC-96V型MJ Research热循环仪上，通过变性、杂交和DNA延伸的温度步骤进行循环(最多50次)。

DNA分析

可用各种方法，包括用质谱、毛细管凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行分子大小鉴别来分析PCR产物。如果设计的PCR扩增子含有不同的限制性酶切位点，可用DNA-结合柱或沉淀纯化PCR反应中的DNA，用水重悬，然后用合适的限制性酶进行限制性切割。然后将限制性切割的DNA作琼脂糖凝胶电泳，利用电流对DNA进行大小分离。某基因的各种等位基因根据是否含有限制性位点而具有不同大小。

                       实施例2

          鉴定诊断性标记基因与这些基因的优先排序

就组1而言，按照Lonnstedt和Speed的经验性Bayes方法(Lonnstedt和Speed，2002，Statistica Sinica，12：31-46)分析动物在感染EHV前后基因表达的差异。比较感染后各时间点与感染前时间点进行分析。利用各动物作用的多种术语，临床状态(感染EHV前后)术语，按照各基因拟合为通用线性模型。按照诸基因在各临床状态组之间差异性表达的后时性差异(posterior odds)对它们排序。只记录统计学显著改变的那些基因(根据经验性Bayes缩小标准偏差(shrunken standard deviation)用t统计来评估)。利用p值的Holm校正(Holm，S.，1979，Scandinavian Journal of Statistics，6：65-70)维持对1型误差率强有力控制。在感染后的每天将EHV感染前后显示统计学有显著差异的基因列成表格。

此外，将临床受影响的动物(证实有EHV感染的临床体征)与健康动物作比较；将视作具有“活动性病毒感染”的动物与健康动物(“活动性病毒感染”的动物通常包括在已知EHV感染后的大约7天时期)作比较进行分析。

表5显示了在这些分析后根据p值排序差异显著的基因。此分析再次根据经Holm方法校正了p值的两组比较。这些表格中的“效果大小(effectsize)”(M)代表对数值，表明与对照相比基因表达改变的倍数。负值代表下调而正值代表上调。t统计与p值是本文所述的有意义值。B统计是差别表达的Bayesian后时性对数差异(Bayesian posterior log odds of differentialexpression)。

表6显示了在这些分析后根据T值排序差异显著的基因。标记表明哪种基因上调与哪种基因下调(负或正“差异”与t值)，“差异”表明反应的幅度。此分析再次根据经Holm方法校正p值的两组比较。

                       实施例3

         证明对测定疱疹病毒感染具有诊断潜力

根据基因表达计算的主要组分评分(Jolliffe，I.T.，《主要组分分析》(Principal components analysis)，Springer-Verlag，1986)采用辨别分析(Venables和Ripley，2002，《统计学在S中的现代应用》(Modern AppliedStatistics in S)，Springer)评估了感染后各时间点的整组基因的诊断潜力。整个方法经交叉验证。每次去除(drop)一只动物进行交叉验证(而不是一次观察)。灵敏度和特异性经计算均为优先级(uniform prior)。这可解释为一种形式的缩小调节，将这些估算值缩小到减小的范围(reduced space)内。

利用交叉验证的辩别函数评分(discriminant function scores)来估计接收器操作曲线。将关键阈值沿着判别函数评分的轴移动来计算接收器操作曲线。计算两种原始检验性ROC，采用Lloyd的方法校平ROC(Lloyd C.J.，1998，Journal of the American Statistical Association，93：1356-1364)。计算的曲线用于临床阴性和临床阳性动物的比较。利用感染后每天的基因表达计算不同曲线。采用梯形规则，计算接收器操作曲线下面积，应用于经验性ROC与校平的ROC。

可用ROC总结某试验的诊断潜力。完美的诊断试验的ROC是一条通过灵敏度与特异性均等于1的点的水平线。这种完美诊断(试验)的ROC下面积是1。无用的诊断试验的ROC是一条通过原点的45度线。这种无信息诊断(试验)的面积是0.5。

表8显示了组1各幼驹感染后第2、4、13和20天取得的样品的灵敏度、选择性和ROC下面积。从这些结果可知，有证据表明感染后第2和4天的诊断潜力强，而很少有证据表明在第13或第20天有诊断潜力。

此外，在组1幼驹有症状与无症状时间点相对应的感染后第0、13和20天时期与感染后第2、4和6天之间作比较。图1显示用于比较的ROC。ROC比较的灵敏度与特异性分别是1与0.867。经验与校平ROC下的面积分别是0.892与0.952。这些(结果)为对应于有症状EHV感染的差异性基因表达提供了强有力证据。

此外，利用临床感染动物的所选择基因得到ROC曲线(图2)。利用基因表达标记的此检验灵敏度和特异性均优秀。

此外，利用有活动性病毒感染动物的所选择基因得到ROC曲线(图3)。利用基因表达标记的此检验的灵敏度和特异性均优秀。

此外，利用临床感染动物的所有基因得到ROC曲线(图4)。利用基因表达标记的此检验的灵敏度和特异性均优良。

此外，利用有活动性病毒感染动物的所有基因得到ROC曲线(图5)。利用基因表达标记的检验的灵敏度和特异性均优良。

根据芯片上整组基因的缩小估计值，以此方式计算的接收器操作曲线是保守的，即，它们倾向于低估诊断潜力。根据所选择的基因亚组在操作性诊断中应能获得更好的诊断性能。

表7给出了组1幼驹在第2、4、6、13和20天与第0天相比的血液学与生物化学结果，临床参数(心率(HR)与呼吸率(RR))与这些参数的统计学显著性。除了PCV(压积细胞体积)外的所有检测值均有统计学显著性，这些检测值最可能反映了疱疹病毒感染的相关变化。然而，这些变化是非特异性的，也可能与许多其它病症有关。组2幼驹的这些参数未提供相似结果，它们没有显著性差异，经管事实上虽然这些幼驹受到亚临床感染。

图6是组1幼驹的基因表达指数(Log强度单位)、血清EHV Ab水平(450nm吸光度)、日期、天数(D＝天)、临床体征的图。组1幼驹于2003年3月18日接种(实验性感染)。基因表达指数的变化与临床体征的存在相对应，比血清抗-EHV-1抗体的出现早10-14天。这可能在出现临床体征期间，比抗体检验早10-14天诊断疱疹病毒感染对治疗和控制特别有实际意义。例如，目前的药物就是在此期间最有效，而对许多疱疹病毒感染而言，动物也在此期间最具传染性。

图7包括利用组1幼驹所有基因的前4种主要组分基因表达的图。各组分按照接种后的天数作图。从这些图中明显可知基因表达的主要变化发生在接种疱疹病毒后的10天期间。此期间也与临床体征的存在相对应(参见图2)。

由于组2幼驹在不同时间点经历不受控制的天然感染，用组1幼驹的数据为基础对各样品的基因表达分类(classifier)进行训练来预测组2幼驹的EHV感染状态。此预测包括预测的最大后时性概率(posterior probability)与预测的鉴别函数评分(其是样品各基因的线性组合)。表9显示了预测的类型(EHV感染阳性和阴性)与鉴别评分。

利用血清EHV-1Ab结果，确定4只幼驹(360、364、368和369：见表9)均可能在-4天受到天然感染(即实验开始(第0天)前4天)。在这些动物中，幼驹364和368分别在第0和第2天与第2天出现临床体征。当我们利用此基因方法分类时，值得注意的是在第0和第4天之间的某些天或所有4天这些幼驹各自确定受EHV-1感染。这表明此EHV-1基因特征可以是EHV-1的诊断(指标)，而不论动物是否显示临床体征。利用血清EHV-1Ab结果，确定幼驹362在-1天受到天然感染，这意味着应能在第-1天和第6天间任何时刻检测到特征。利用此基因分类方法，在第0、2和6天此幼驹中均观察到阳性结果(意味着“受感染”)。但此动物没有出现临床体征。根据血清EHV-1Ab结果，幼驹375在第6天左右诊断受感染。在第2、4和6天观察到阳性分类结果，但也没有出现临床体征。利用血清EHV-1Ab结果，直至第14天仍不能确定幼驹366受到天然感染，这意味着血清阳转将发生在第27或28天。应注意试验2的动物在第21天均受攻击(challenged)。因此，此幼驹在第21天是血清阴性。除了在第23天有轻微临床体征外，幼驹366未产生任何临床体征。这些结果表明血清Ab水平(体液免疫力)在实验攻击之时(第21天)几乎足以保护动物而不会产生临床疾病的明显体征。因此，当在实验性接种后的时期应用此基因表达分类方法时我们未观察到任何阳性结果。

因此，当组2幼驹显示出组1幼驹得到的初步分类指征即使在有或没有临床体征(或血液学与生物化学的任何显著改变)存在下均可鉴定EHV-1早期天然感染。

                          实施例4

                   具有预测性能的各组基因

虽然鉴定到约63种具有诊断潜力的基因，但通常可接受的诊断性能只需要很少数目的基因。

表10显示根据选自具有诊断潜力基因的组中两种基因的线性鉴别分析获得的交叉验证分类结果、灵敏度和特异性。提出的诸对基因是能产生最高预测结果的基因，许多其它基因对产生可接受的分类结果。本领域技术人员不难鉴定其它基因对。鉴定基因对的技术包括(但不限于)正向可变性选择(Venables W.N.和Ripley B.D.，《统计学在S中的现代应用》(ModernApplied Statistics in S)，第四版，2002.，Springer)、最佳亚组选择、反向(backward)消除(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)选择(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)和随机可变消除(FigueradoM.A.，《监督学习的适应性稀疏》(Adaptive Sparseness for SupervisedLearning))。

表11显示根据选自诊断组三种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组三种基因。本领域技术人员不难明白可根据三种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表12显示根据选自诊断组四种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组四种基因。本领域技术人员不难明白可根据三种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表13显示根据选自诊断组五种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组五种基因。本领域技术人员不难明白可根据五种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表14显示根据选自诊断组六种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组六种基因。本领域技术人员不难明白可根据六种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表15显示根据选自诊断组七种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组七种基因。本领域技术人员不难明白可根据七种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表16显示根据选自诊断组八种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组八种基因。本领域技术人员不难明白可根据八种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表17显示根据选自诊断组九种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组九种基因。本领域技术人员不难明白可根据八种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表18显示根据选自诊断组十种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组十种基因。本领域技术人员不难明白可根据十种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表19显示根据选自诊断组二十种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组二十种基因。本领域技术人员不难明白可根据二十种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

表20显示根据选自诊断组三十种基因进行线性鉴别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组二十种基因。本领域技术人员不难明白可根据二十种HVI标记基因作出其它合适的诊断选择。

其它基因可能通过过度拟合(over-fitting)引入噪声(随之降低交叉验证的灵敏度与特异性)。

                         实施例5

                       特异性的证实

通过只根据试验数据进行训练分类和对超过850个GeneChip^TM的大基因表达数据集运行此分类，检验了所述疱疹病毒标记的特异性。该数据库中的基因表达结果得自患各种疾病与病症的马样品，所述疾病与病症包括：临床诱导的急性与慢性EPM、疱疹病毒感染、退变性骨关节炎、应激、红球菌感染、内毒素血症(endotoxaemia)、蹄叶炎、胃溃疡综合征、运动训练的动物与临床正常的动物。

得到了两种分类结果。二者依据活动性病毒感染的与临床正常的马匹的比较。前者利用了GeneChip^TM上的所有基因。后者只利用了表1所列的那些基因。后者的标记能够鉴定所有已知EHV-感染的动物。也鉴定出25匹未知EHV状态的其它马匹，包括作为另一临床试验一部分的处于应激下的动物，具有红球菌马感染相关的已知肺部病损的5匹幼驹。

利用此方法与63种基因的基因标记，从850个以上的一群样品中检测到疱疹病毒感染的特异性为95％，灵敏度为100％。

                         实施例7

                         基因本体

为根据功能、代谢过程或细胞组分对基因分组，采用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.，(1990)，“局部序列比对基本检索工具”(Basic local alignment search tool)，J.Mol.Biol.，215：403-410)将基因序列与GeneBank数据库作比较，进行基因同源性和基因本体检索。根据这些标准，表21列出了这些基因的分组。某些情况没有可利用的信息(NA)。也参见含有各基因的序列信息的表1。

本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的内容全文纳入本文作为参考。

本文所引用的任何参考文献不应理解为承认该参考文献是本申请可利的“现有技术”。

整篇说明书的目的是描述本发明的优选实施方案而不是将本发明限制于某一实施方案或特征的特定组合。本领域技术人员应知道鉴于本文内容可对示范的具体实施方案作出各种改进与改变而不脱离本发明的范围。所有这种改进与改变要包括在附加的权利要求书的范围内。

                                                   表1

                                       表2