吉西他滨促进HepG2.2.15细胞系中乙肝病毒pgRNA转录和病毒复制及相关分子机制研究

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

目的：我国乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV)感染和肿瘤的发病率居高不下，使得合并HBV感染的肿瘤病人人数众多。然而，部分市面上的抗肿瘤药物表现出对HBV的再激活活性，给感染乙肝病毒的肿瘤病人的常规治疗带来不利影响。目前，已有多种抗肿瘤药物导致的HBV再激活被报道，而近来临床上也发现常用抗肿瘤药物吉西他滨具有再激活HBV的活性，但相关的分子机制不明。为进一步探讨抗肿瘤药物再激活HBV机制，本研究以HepG2.2.15细胞为载体，观察经吉西他滨刺激后的细胞水平及分子水平的效应，分析关键信号通路及作用靶点，以期为抗肿瘤药物再激活HBV机制提供素材，为找寻药物再激活HBV的共性奠定基础。　　方法：培养已转染入乙肝病毒全基因组的HepG2.2.15细胞，用不同浓度吉西他滨处理细胞。　　（1）用0、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、70、100μmol/L吉西他滨处理细胞，分别在24h、48h、72h使用CCK8法检测细胞活性。　　（2）用0、2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨处理细胞48h，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。　　（3）用0、2、20、50μmol/L吉西他滨处理细胞24h、48h、72h、96h，用实时荧光定量PCR法检测细胞内乙肝病毒前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的表达量。　　（4）用0、2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨处理细胞24h，ELISA法检测细胞培养上清液中乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg），实时荧光定量PCR法检测上清液中HBV DNA。　　（5）用0、2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨处理细胞48h，实时荧光定量PCR法检测细胞内与乙肝病毒pgRNA的转录相关的调控基因：肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor4，HNF4α）、P38蛋白激酶（P38mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1（CAMP Responsive Element Binding Protein1，CREB1）、核转录因子p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-kb p65）、组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1，HDAC1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1-alpha，PGC-1α）、叉头转录因子O1（forkhead box protein O1，FOXO1）、相关调控基因沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin1，SIRT1）、P53mRNA以及乙肝病毒pgRNA表达量。根据既往研究中细胞信号通路，以及这些基因调控pgRNA转录机制之间的相互联系，将这些调控基因划分为三条主要途径：途径一，P38MAPK以及其下游的转录因子NF-kB、CREB1、P53途径；途径二，转录因子HNF4α、FOXO1以及转录共激活因子PGC-1α途径；途径三，去乙酰化酶HDAC1和SIRT1途径。分别用各转录调控基因mRNA、乙肝病毒pgRNA后一浓度表达量减去前一浓度表达量，对得到的乙肝病毒pgRNA的差值、各基因mRNA的差值进行相关性分析，分析乙肝病毒pgRNA与各mRNA随吉西他滨浓度变化趋势的相关性。（6）用0、0.1、0.2、2、20、50、70和100μmol/L吉西他滨处理细胞24h，Western Blot法检测蛋白HNF4α的表达量。　　（6）用0、0.1、0.2、2、20、50、70和100μmol/L吉西他滨处理细胞24h，Western Blot法检测蛋白HNF4α的表达量。　　结果：（1）吉西他滨对HepG2.2.15细胞的生长具有抑制作用，在72h内呈浓度和剂量依赖性。24h细胞活性约75-100%；48h细胞活性约30-65%；72h细胞活性约15-50%；且各时间点细胞活性随吉西他滨浓度增加而降低。（2）吉西他滨增加HepG2.2.15细胞的凋亡率，2、20、50、70、100μmol/L浓度的吉西他滨凋亡率分别为（2.90±0.92）%、（6.20±1.08）%、（7.87±0.72）%、（6.10±0.57）%和（4.73±0.51）%，与对照组（0.70±0.10）%相比，增加明显（P分别为0.014、0.001、0.003、0.043和0.000）；吉西他滨导致HepG2.2.15细胞更多的停滞在G0G1期，而处于S期细胞比例降低，2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨组处于G0G1期细胞所占比例分别为（72.31±3.77）%、（71.66±3.19）%、（73.63±5.51）%、（69.93±3.62）%和（73.23±5.37）%，与对照组G0G1期所占比例（39.36±2.86）%相比，增加明显（P值分别为0.000、0.000、0.001、0.000和0.001）；2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨组处于S期细胞所占比例分别为（16.91±2.74）%、（16.49±5.58）%、（17.65±3.33）%、（18.53±3.91）%和（18.59±1.91）%，与对照组S期所占比例（49.37±2.38）%相比，减少明显（P值分别为0.000、0.001、0.000、0.000和0.000）。　　（3）吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞内乙肝病毒pgRNA相对表达量，所有浓度吉西他滨作用细胞24、48、72h，与对照组相比，用药组乙肝病毒pgRNA表达量均增加（P值均小于0.05），且呈明显的时间与剂量依赖性；吉西他滨作用92h，乙肝病毒pgRNA也有增加的趋势。（4）吉西他滨作用细胞24h，2、20、50、70、100μmol/L吉西他滨组上清中HBeAg分别为（14.90±2.07）、（23.70±0.10）、（17.30±2.82）、（23.23±1.20）、（16.07±1.79）S/CO，与对照组（7.26±2.11）S/CO相比明显增加（P值分别为0.011、0.005、0.008、0.000、0.005）。　　（5）HNF4α、P38MAPK、CREB1、NF-kb p65、HDAC1、PGC1α、FOXO1、SIRT1、P53mRNA与乙肝病毒pgRNA变化趋势的相关系数r分别为0.934、0.715、0.487、0.638、0.767、0.526、0.716、-0.231和0.434，P值分别为0.020<0.05、0.175、0.406、0.247、0.130、0.362、0.173、0.709和0.465，所有三条途径中，吉西他滨导致HNF4αmRNA表达量增加，且HNF4αmRNA变化趋势与乙肝病毒pgRNA变化趋势相关性最高，通过既往研究可知HNF4α对乙肝病毒pgRNA的转录起促进作用，因此认为吉西他滨是通过促进HNF4α的表达从而促进乙肝病毒pgRNA的转录和乙肝病毒的复制。　　（6）吉西他滨可增加HepG2.2.15细胞中HNF4α蛋白表达，这从蛋白水平进一步支持以上mRNA水平的结果。　　结论：吉西他滨对HepG2.2.15细胞的生长显示出浓度以及剂量依赖性的抑制作用；吉西他滨使细胞凋亡率增高；吉西他滨使细胞更多的停滞在G0G1期，而处于S期细胞比例减少；吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞内乙肝病毒pgRNA，72h之内呈现明显的时间与剂量依赖性；吉西他滨作用细胞24h会使细胞培养上清液中的HBeAg增加；吉西他滨促进HNF4αmRNA、HNF4α蛋白质表达量增加，且在所有与乙肝病毒转录调节有关的基因中，HNF4αmRNA变化趋势与HBV pgRNA变化趋势相关性最高。吉西他滨可在细胞水平促进乙肝病毒pgRNA转录以及乙肝病毒的复制，其机制为通过促进乙肝病毒转录因子HNF4α的表达实现的，并非通过其它基因（P38MAPK、CREB1、NF-kb p65、HDAC1、PGC1α、FOXO1、SIRT1、P53）实现。

著录项

作者
叶雨笙;
展开▼
作者单位

西南医科大学;

展开▼
授予单位西南医科大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名熊杰;
年度 2019
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类
关键词
抗肿瘤药物,吉西他滨,乙肝病毒,激活机制;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 巯基化Ras相关蛋白7a抑制人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV复制 [J] . 宋佳茹 ,朱席琳 ,伍晓盼 . 基础医学与临床 . 2020,第001期
2. HepG2.2.15细胞系中HBV复制相关抑制因素的变化 [J] . 谢霞 ,陈燕 ,顾琳 . 实用医学杂志 . 2011,第011期
3. 拉米夫定抑制HBV相关性肝癌HepG2.2.15细胞病毒复制、细胞增殖的实验研究 [J] . 陈林涛 ,李功权 . 医学检验与临床 . 2019,第012期
4. 乙肝患者外周血单个核细胞中乙肝病毒复制中间体RNA与乙肝病毒DNA相关性的研究 [J] . 张凯宇 ,蔡艳俊 ,王峰 . 临床肝胆病杂志 . 2001,第003期
5. 核转录因子E2相关因子2和Keap1的分子结构和功能及其信号通路调控分子机制研究进展 [J] . 王朝阳 ,荆黎 . 中国药理学与毒理学杂志 . 2016,第005期
6. CN-Ⅱ在非小细胞肺癌细胞系中的表达及其与吉西他滨耐药的相关性研究 [C] . 曲莉莉 ,刘晓晴 ,王伟霞 . 第14届世界冷冻治疗大会暨第一届国际冷冻免疫学大会、第三届中国肿瘤靶向治疗大会 . 2007
7. 转录因子FoxO3a在乙肝病毒复制中的作用及机制研究 [A] . 孙世仁 . 2009

吉西他滨促进HepG2.2.15细胞系中乙肝病毒pgRNA转录和病毒复制及相关分子机制研究

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅