miR-29c通过胰岛素样生长因子1抑制人血管内皮细胞迁移和血管生成的研究

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第一部分 miR-29c对血管形成相关转录因子表达的影响　　目的:探讨miR-29c对血管形成相关转录因子表达的影响。　　方法：培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并构建miR-29C mimics和miR-29C inhibitor转染。通过Real-time PCR检测miRNA转染后相关因子mRNA的表达，Western Blot检测miRNA转染后相关因子蛋白的表达，免疫荧光检测VEGF表达。　　结果：人脐静脉内皮细胞转染miR-29c模拟物造成PI3K，AKT和VEGF mRNA和蛋白表达水平的显著下降(P<0.01)，但IGF-1仅表现为蛋白水平下降，mRNA表达却无明显改变(P>0.05)。免疫荧光细胞组化检测结果显示，人脐静脉内皮细胞转染 miR-29c模拟物能明显抑制VEGF表达(P<0.05)，而转染 miR-29c抑制剂组 VEGF表达增强(P<0.05)。　　结论：miR-29c能够抑制血管形成相关转录因子 PI3K、AKT和VEGF的mRNA和蛋白表达。同时，miR-29c能下调IGF-1的蛋白表达，但不影响其mRNA表达，提示其对IGF-1的作用为转录后调节，即翻译抑制。　　第二部分 miR-29c对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响　　目的:探讨miR-29c对人脐静脉内皮细胞增殖活性、迁移能力及血管形成能力的影响。　　方法：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养并转染。通过 MTT、EdU检测转染对细胞增殖能力影响，流式细胞分析术检测细胞周期变化，Transwell检测细胞的迁移能力变化，小管形成实验检测细胞的血管形成能力变化。　　结果：在人脐静脉内皮细胞转染miR-29c模拟物组，HUVECs和293-T细胞的增殖率分别下降了57.6％和36.3%，与空白组对照有显著性差异（P<0.05）；转染miR-29c模拟物组与其余组比较，DNA合成S期的细胞数量最少，进入G2期的细胞数量最多，HUVECs增殖活性明显下降，HUVECs迁徙能力明显减弱，较空白对照组下降了31%，较转染 miR-29c抑制剂组下降64%；细胞血管生成能力显著下降，生成血管的直径较小且成环率降低（P<0.05）。转染miR-29c抑制剂组与其余组比较，DNA合成S期的细胞数量最多，HUVECs增殖活性明显增强，HUVECs迁徙能力明显增强，细胞血管生成能力也有加强（P<0.05）。　　结论：miR-29c能抑制HUVECs的增殖活性、细胞移行及血管形成，这可能由于 miR-29c的表达对内皮细胞生长因子的信号通路有影响，进而影响了细胞的生物学行为。　　第三部分 miR-29c抑制人脐静脉内皮细胞血管生成的分子机制研究　　目的:探讨miR-29c抑制血管形成能力的机制。　　方法：培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后进行miRNA靶向基因的生物学预测。通过构建IGF-13’UTR端荧光素酶质粒后进行荧光素酶报告基因检测及细胞划痕实验研究 miR-29c抑制人脐静脉内皮细胞血管生成的分子机制。　　结果：miR-29c模拟物能明显降低IGF-13′UTR萤光素酶报告基因的荧光强度（P<0.05）；但是却不能降低IGF-13′UTR突变组萤光素酶报告基因的荧光强度（P>0.05）。当加入miR-29c抑制物后，IGF-13′UTR萤光素酶报告基因的荧光强度明显增加（P<0.05），但突变较对照组没有明显变化（P>0.05）。细胞划痕24h后，转染miRNA-29c mimics的人脐静脉内皮细胞（ HUVECs）组划痕愈合的速度明显弱于转染miRNA-29c inhibitor的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（P<0.01，图3.3、3.4）；当转染miRNA-29c mimics的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）加入IGF-1后，划痕愈合的速度明显增加（P<0.05），提示IGF-1拯救了miRNA-29c导致的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁徙能力降低的现象。　　结论：IGF-1/PI3K/AKT/VEGF途径可以调节血管的生成， miRNA-29C通过靶向结合在IGF-1的3′UTR端，从而抑制IGF-1在翻译水平的表达。IGF-1的表达抑制下调了下游通路的相关基因如PI3K、AKT和VEGF的表达，最终抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的成血管能力。

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作者
胡赟;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科临床检验诊断学
授予学位博士
导师姓名邓锋;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类
关键词
miR-29c蛋白,胰岛素样生长因子1,血管内皮细胞,血管生成,细胞增殖,细胞迁移,分子机制;

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