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拟南芥AtEMB1211在胚胎发生和叶绿体发育过程中功能的初步分析

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第一章前言

1.1胚胎发育过程

1.1.1顶细胞和基细胞的形成

1.1.2胚体和胚柄的形成

1.2植物胚胎发育过程中的基因调控

1.2.1合子激活

1.2.2胚极性的建立

1.2.3分生组织的形成

1.3叶绿体的发育

1.3.1叶绿体的来源

1.3.2叶绿体的结构和功能

1.4胚胎发育与质体或叶绿体发育的关系

1.4.1叶绿体在胚胎发育时期的形成与分化

1.4.2质体/叶绿体发育缺陷对胚胎发育的影响

1.5研究背景、意义和内容

第二章实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验样品

2.1.2菌种

2.1.3载体

2.1.4工具酶

2.1.5测序及引物合成

2.1.6试剂盒

2.1.7分子量标准

2.1.8化学试剂

2.2实验方法

2.2.1拟南芥的栽培

2.2.2 CTAB法提取基因组DNA

2.2.3扩增T-DNA侧翼序列

2.2.4半定量RT-PCR

2.2.5胚发育观察

2.2.6透射电镜制备

2.2.7AtEMB1211 基因启动子与GUS融合载体构建

2.2.8拟南芥转化(Floral Dipping法)

2.2.9转基因植株的筛选和鉴定

2.2.10 GUS染色及观察

第三章结果与分析

3.1 emb1211突变体的分离和鉴定

3.2纯合的emb1211突变体幼苗期的发育

3.3 emb1211突变体胚胎发育异常

3.4 emb1211-2与emb1211-3为等位突变

3.5纯合的突变体胚和幼苗中叶绿体的发育

3.6 EMB1211基因的表达模式

3.7 EMB1211蛋白含有保守的MORN基序

第四章讨论、结论与展望

4.1 拟南芥EMB1211编码包含MORN基序的蛋白

4.2拟南芥EMB1211对于叶绿体早期发育起着重要作用

4.3叶绿体的发育对胚胎发生的影响

4.4结论与展望

参考文献:

致谢:

在读期间研究成果

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摘要

叶绿体发育对胚胎发生和幼苗生长起着至关重要的作用。近年来,为了阐明叶绿体发育和功能的分子机制研究者们做了大量的工作,然而关于胚胎时期叶绿体发育调控和功能的研究还很少,叶绿体早期发育与胚胎发育之间的关系还没有得到明确的阐述。本研究中我们分离到一个拟南芥T-DNA插入突变体,通过对T-DNA插入位点的详细分析,发现该突变为emb1211-1(embryo-defective1211)和emb1211-2的等位突变,并命名为emb1211-3。EMB1211编码一个N端含有三个MORN基序(motif)的蛋白。我们采用显微、亚显微技术和分子生物学方法对该突变体的表型、结构及AtEMB1211基因的功能进行了分析,其结果如下: 1观察受粉后7天的杂合突变体种荚发现,大部分胚珠由于叶绿体的发育呈现绿色,约有25%的胚珠为白色;杂合突变体与野生型互交分析发现雌雄配子的发育不受影响,说明该基因突变导致胚胎发育缺陷; 2微分干涉相差显微镜观察突变体胚胎发育过程发现,白色胚胎从晚球形期开始发育缓慢且形态异常,停滞于鱼雷期;最后形成干瘪且颜色暗黑的种子,它们在土壤里不能萌发,仅在培养基上培养时,形成植株矮小且发育缓慢的白化苗; 3对杂合突变体后代进行遗传连锁分析发现,表型和基因型紧密连锁;对该基因另一突变体emb1211-2的研究发现,它与emb1211-3具有相似的表型,且它们互交后代的表型与亲本相似,说明两者为等位突变; 4对突变体鱼雷期胚和白化苗子叶进行透射电镜分析发现,两种组织都没有正常叶绿体的形成,仅存在处于发育早期的质体,没有类囊体膜的形成; 5基因型鉴定和RT-PCR结果显示这些白化苗为纯合突变体;用RT-PCR方法对EMB1211在不同组织中的表达进行检测时发现:它在根、花序中的表达很弱,在茎、叶、种荚中的表达较强,在胚胎中的表达最强; 6为进一步分析EMB1211在胚胎时期的表达模式,将该基因的启动子与GUS报告基因融合并转化野生型拟南芥,阳性转基因植株的GUS染色分析发现:在绿色组织中EMB1211均有表达,且子叶和新生叶表达较强;在早心形期到子叶期各时期的胚中EMB1211均有特异性表达,与上述RT-PCR结果相一致。 以上结果表明,AtEMB1211基因突变导致叶绿体早期发育阻断进而造成胚发育缺陷,说明AtEMB1211在拟南芥胚胎发育和叶绿体早期发育过程中发挥重要作用,也证实了质体或叶绿体的发育分化对胚胎发育具有重要影响。

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