• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >日本血吸虫对继发感染伯氏疟原虫C57BL/6小鼠免疫应答的影响及其机制研究
【6h】

日本血吸虫对继发感染伯氏疟原虫C57BL/6小鼠免疫应答的影响及其机制研究

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

论文一 日本血吸虫对继发感染伯氏疟原虫C57BL／6小鼠产生的脑疟的作用

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 日本血吸虫对继发感染伯氏疟原虫C57BL／6小鼠的树突状细胞应答的影响

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 日本血吸虫对继发感染伯氏疟原虫C57BL／6小鼠的Th1／Th2应答的免疫调节机制

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 疟疾和蠕虫混合感染的研究现状及其免疫相关机制的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介

展开▼

摘要

前言：　　疟疾是由疟原虫所引发的感染性疾病，长久以来严重影响人类的健康。目前世界上约有3亿人感染疟疾，每年新发病例约200万人，儿童的发病率远远高于成人。在非洲地区，疟疾是最为常见的引发死亡的致病因素之一。每年因疟疾死亡的儿童超过60万人。感染恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，P.falciparum）可引发脑疟，它是一种致死性的感染性疾病，主要引发神经系统的改变，症状重且死亡率高。因此，当前关于脑疟的研究是热点之一。在动物实验研究中，常用伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA，P.berghei ANKA)感染C57BL/6小鼠建立实验性脑疟模型（Experimental cerebral malaria，ECM），研究证实这种模型与人类脑疟极为相似，且C57BL/6小鼠对脑疟具有很强的易感性。在ECM发病过程中会出现感染红细胞沉积于脑部毛细血管，并继而引发免疫细胞及血小板粘附于脑部血管内皮细胞上，引发脑部出血和水肿，同时引发血脑屏障通透性的改变。　　一般说来，强烈的Th1应答是脑疟的主要特征，在疟疾感染早期，树突状细胞(Dendritic Cell，DC)在诱导产生获得性免疫应答中起到了重要作用。成熟的DC是活化初始T细胞的唯一抗原提呈细胞，可启动并介导初始T细胞向Th1、Th2或Treg等不同亚群分化。体外研究表明，DC可选择性吞噬疟原虫寄生的红细胞（Parasitized red blood cell，pRBC），加工和提呈疟原虫抗原给CD4+T细胞进而诱导保护性Th1细胞免疫应答的建立。这充分提示，作为抗原提呈细胞的DC在疟疾感染过程中可能发挥重要作用。前期研究已经证实，在疟疾感染过程中，DC参与了T细胞介导的免疫应答的建立和调节。此外，DC分泌的前炎性细胞因子IL-12与免疫调节性细胞因子IL-10或TGF-β之间处于动态平衡模式，该平衡的移动可影响Th1细胞免疫应答的启动和调控。　　在Th1免疫应答建立之后，由Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体，能够有效地清除疟原虫，防止复发。普遍认为，使前炎症因子和抗炎症因子保持适当的平衡能够有效地控制脑疟的严重程度。若缺乏最初的炎症期则导致原虫大量增殖;若炎症应答不能控制在一定程度之下则会导致严重的免疫病理损伤。CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞(Regulatory T cell，Tregs)在调节这种平衡中起到了关键的作用。研究已经证实Tregs通过限制前炎症免疫应答使BALB/c鼠抵抗脑疟。研究同样证实了在伯氏疟原虫感染过程中出现的Tregs与产生的IFN-γ呈负相关。诱导产生的或活化的Tregs有利于脊椎动物宿主，因为它能够下调炎症免疫应答，从而防止产生免疫介导的病理损伤。　　血吸虫病是热带或亚热带地区另一种常见传染性疾病之一，其发病率仅低于疟疾。常见有三种血吸虫种属感染人类:曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni,S.mansoni)、埃及血吸虫（Schistosoma haematobium，S.haematobium）以及日本血吸虫（Schistosoma japonicum，S.japonicum）。最近有研究表明，蠕虫感染可减低机体内的前炎症因子的水平，从而可对蠕虫与其它寄生虫的混合感染产生影响。由于蠕虫与疟原虫在很多区域同时流行，因此常可观察到血吸虫病和疟疾共同感染的现象。目前关于蠕虫与疟疾混合感染的研究已有很多，但研究所得出的结果大多互相矛盾。有研究表明曼氏血吸虫感染会导致恶性疟原虫感染率的增高，而其它研究却发现埃及血吸虫感染会降低继发疟疾感染中原虫血症的虫荷、降低疟疾的发病率，从而证明埃及血吸虫感染对疟疾起到一定的保护作用。有人认为这些研究所得出的结果之所以相互矛盾可能与研究中所用的蠕虫种属不同有关。当前，在研究血吸虫参与的免疫应答中，曼氏血吸虫的应用最为常见。目前关于日本血吸虫与疟原虫混合感染的研究尚未见报道。有研究证明，与曼氏血吸虫感染相比，日本血吸虫感染会引发更加严重的肝部病变，说明日本血吸虫感染与曼氏血吸虫感染可引发显著不同的组织病变。　　本研究利用日本血吸虫与伯氏疟原虫混合感染C57BL/6小鼠，并与伯氏疟原虫单独感染的小鼠进行比较，分析血吸虫混合感染对ECM的作用及对小鼠感染进程及结局的影响。旨在通过对比分析宿主固有免疫和适应性免疫应答特点，进一步揭示疟原虫与血吸虫共同感染的相关细胞和分子机制，以期为疟疾流行区新的防控策略的确立提供理论依据。　　实验材料与方法：　　1、实验动物及模型构建　　6～8周龄，雌性C57BL/6小鼠经尾静脉分别感染100或200条S.japonicum尾蚴，8周后经腹腔分别感染1×106或1×105P.berghei ANKA，分别建立4种感染不同寄生虫虫荷/数量的混合感染模型。单独感染不同虫荷的P.berghei或S.japonicum及未经感染的小鼠用作对照组。监测原虫血症水平、生存率及ECM临床评分指标。　　2、小鼠脑组织病理学检查　　1)取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μn切片。　　2)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗:二甲苯(Ⅰ)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。　　3)苏木素染色5min，自来水冲洗。　　4)盐酸乙醇分化30s（提插数下）。　　5)自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。　　6)置伊红液2min。　　常规脱水，透明，封片:95％乙醇(Ⅰ)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(Ⅰ)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3∶1)1min→二甲苯(Ⅰ)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。　　3、小鼠血脑屏障通透性检测　　1)将各组小鼠尾静脉注射200μl2％伊文思蓝染料。　　2)1h后，心脏灌注生理盐水而至流出清亮液体为准，然后取脑，拍照。　　3)将各组小鼠的脑组织放入离心管中，管内加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h。　　4)将各管取出，3000rpm离心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。630nm检测OD值。　　4、Real-time RT-PCR检测脑组织中相关因子mRNA的相对表达　　脑组织Total RNA的提取及反转录:用Trizol按照说明书提取脑组织RNA，然后使用分光光度计测定浓度。用PrimeScriptTMRT试剂盒（Takara公司）去除基因组DNA，将RNA反转录成cDNA。反转录体系为20μl，含有PrimeScriptTM缓冲液，PrimeScriptTMRT酶混合物，oligodT引物（50μM）和随机引物两种（100μM）及500ng总RNA。Real-time反应:用得到的cDNA作为模板和特定引物进行PCR反应。使用SYBR(@)PremixExTaqTM试剂盒进行定量PCR。反应条件如下:95℃预变性30秒，40个PCR循环（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化各组之间的相对基因表达。　　5、脑组织中CD4+/CD8+T细胞检测　　取脑组织，150目筛网研磨脑，并分离单个核细胞。将组织置入5mlRPMI1640（含100U/mlⅣ型胶原酶）中获取单细胞悬液，42℃培育45分钟。30％Percoll中重悬。300g离心10min，收集细胞沉淀，用30％Percoll重悬沉淀，然后加入到70％Percoll上层（用PBS配制），515g室温离心30min。收集中间层，加入10mlPBS300g离心10min，标记如下抗体:FITC-anti-CD4，PerCP-Cy5.5-anti-CD8(clone53-6.7)，orAPC-anti-CD3(clone145-2C11)。4℃染色30分钟。PBS洗涤2遍。用2％多聚甲醛固定，流式细胞仪进行检测。利用FlowJo软件分析数据。　　6、脾细胞荧光抗体染色　　无菌取出感染后第1d、3d、5d及8d小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17mol/LNH4C1裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。　　①在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-CD45R/B220-PerCP单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。　　②在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体和抗-CD86-PE单克隆抗体。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。　　③在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC和抗-TLR4-PE单抗。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。　　④在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，按试剂说明书所示，进行固定和透膜后，再分别加入生物素标记的抗-TLR9单抗和PE-streptavidin。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。　　⑤在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，用抗CD4-FITC和抗CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于0.5mlPBS中，流式细胞仪进行检测。　　⑥取部分样品37℃条件下加入ConA刺激2小时后加入Golgi Stop共同培养4小时，用含1％FCS的PBS洗涤后，加入抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE单抗进行双色分析，另设阴性对照管。按试剂说明书所示，进行固定和透膜后，加入抗-Foxp3-APC及抗-PerCP-IL-10。用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μlPBS中，流式细胞仪进行检测。　　⑦取部分样品37℃条件下加入ConA刺激2小时后加入Golgi Stop共同培养4小时，用含1％FCS的PBS洗涤后，加入抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE单抗进行双色分析，另设阴性对照管。按试剂说明书所示，进行固定和透膜后，加入抗-Foxp3-APC及抗-PerCP-IFN-γ。用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μlPBS中，流式细胞仪进行检测。　　7、脾细胞上清细胞因子定量检测　　用ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10及TGF-β的分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMaxPro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　8、统计学分析　　使用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，数据用均数±标准差表示。生存率的比较采用Log-rank(Mantel-Cox)检验。多个样本之间的比较采用方差分析。方差齐采用Bonferroni检验;方差不齐采用Tamhane's T2检验。P＜0.05为具有统计学差异。　　实验结果：　　1、混合感染与伯氏疟原虫单独感染小鼠的原虫血症水平、生存率及ECM临床评分　　从感染开始，各组中的小鼠原虫血症的水平整体呈上升趋势。不论感染高虫荷(106)还是低虫荷(105)的P.berghei，混合感染鼠中的原虫血症水平均较单独感染鼠增高，且与尾蚴感染的数量呈正相关。感染P.berghei后的第6-8天是ECM的发病期，在此期间，大量的小鼠表现出脑疟的临床症状并死亡。混合感染组中小鼠的生存率高于P.berghei单独感染小鼠。在感染低虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染尾蚴的数量可提高小鼠的生存率;而在感染高虫荷P.berghei时，增加感染尾蚴的数量不能显著提高小鼠的生存率。混合感染小鼠的临床评分显著低于P.berghei单独感染小鼠。在感染低虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染尾蚴的数量可显著减低ECM临床评分;而在感染高虫荷P.berghei时，增加感染尾蚴的数量不能显著降低ECM临床评分。　　2、混合感染对脑组织病理学的改变　　P.berghei感染后第6-8天脑组织病理学检查发现，单独感染组小鼠脑部出现单个核细胞聚集，混合感染小鼠脑部病变较单独感染轻微，在增加感染尾蚴数量时，部分小鼠脑部无明显病变。　　3、混合感染对ECM中BBB通透性的影响　　于感染后第6天检测各组小鼠BBB通透性。P.berghei单独感染时，脑组织血管的通透性显著增高，混合感染时可降低BBB通透性。利用比色分析法进行定量分析表明，混合感染组中Evansblue/brain tissue比值显著低于单独感染组。当感染低虫荷P.berghei时，混合感染时增加尾蚴的数量可显著降低该比值;反之，当感染高虫荷P.berghei时，增加感染尾蚴的数量不能明显降低该比值。　　4、混合感染对脑组织中CD4+/CD8+T细胞迁移的影响　　混合感染可显著降低CD8+T细胞的比例。在感染低虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染的尾蚴剂量可显著降低CD8+T细胞的比例;反之，感染高虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染的尾蚴剂量不能明显降低CD8+T细胞的比例。　　5、混合感染对脑组织中相关细胞因子、趋化因子及粘附分子的相对mRNA表达的影响　　通过Real-time RT-PCR方法检测了脑组织中与ECM发生密切相关的IFN-γ、TNF-α及粘附分子ICAM-1和趋化因子CXCL9、CXCL10基因的mRNA相对表达水平。结果显示混合感染可显著降低以上因子的mRNA表达水平。在感染低虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染尾蚴的数量可进一步抑制上述因子的表达水平;反之，在感染高虫荷P.berghei时，混合感染时增加感染尾蚴的数量不能进一步抑制上述因子的表达水平。　　6、混合感染对小鼠脾细胞DC亚群的影响　　所有组别中的小鼠DC亚群在感染P.berghei后数量开始增加，在感染第5天后达到峰值。此外，混合感染可显著降低DC亚群的数量。为了评价感染寄生虫的虫荷或数量改变对混合感染的影响，我们分别采用了两种虫荷的疟原虫和两种数量的血吸虫分别进行混合感染。结果表明，在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量可进一步降低DC亚群的数量;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量不能显著降低DC亚群的数量。　　7、混合感染对小鼠脾细胞DC分子表达的影响　　在感染P.berghei后，所有组别中的小鼠CD11c+MHCⅡ+/CD11c+CD86+数量均开始增加，在感染后第5天达到高峰。此外，混合感染可显著降低上述分子的表达。在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染血吸虫尾蚴的数量可进一步降低该类分子的表达;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染血吸虫尾蚴的数量不会引起显著改变。　　8、血吸虫混合感染对小鼠脾细胞DC中TLR4/TLR9的影响　　在感染P.berghei后，所有组别中的小鼠CD11c+TLR4+及CD11c+TLR9+数量均开始增加，在感染后第5天达到高峰。此外，混合感染可显著降低上述DC的数量。在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染血吸虫尾蚴的数量可进一步降低该类DC的数量;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染血吸虫尾蚴的数量不会引起显著改变。　　9、血吸虫混合感染对小鼠脾细胞Tregs数量的影响　　所有组别中的小鼠Tregs数量在感染P.berghei后开始增加，在感染第5天后达到峰值。此外，混合感染可显著增加Tregs的数量。为了评价感染寄生虫的浓度或剂量改变对混合感染的影响，我们分别采用了两种虫荷的疟原虫和两种数量的血吸虫实行混合感染。结果表明，在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量可进一步增加Tregs的数量;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量不能引起显著改变。　　10、混合感染对小鼠脾细胞IL-10分泌型Tregs的影响　　我们检测了在相应时间点上不同组别的小鼠IL-10分泌型Tregs数量有无变化。结果显示混合感染不能改变其水平。在改变感染寄生虫的虫荷或数量时，此指标亦无明显改变。　　11、混合感染对小鼠脾细胞IFN-γ分泌型Tregs的影响　　所有组别中的小鼠IFN-γ分泌型Tregs的数量在感染P.berghei后开始增加，在感染第5天后达到峰值。此外，混合感染可显著减少IFN-γ分泌型Tregs的数量。为了评价感染寄生虫的虫荷或数量改变对混合感染的影响，我们分别采用了两种虫荷的疟原虫和两种数量的血吸虫分别实行混合感染。结果表明，在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量可进一步减少IFN-γ分泌型Tregs的数量;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量不能引起显著改变。　　12、细胞因子水平的检测　　为了评价混合感染中前炎症因子（INF-γ）与抗炎症因子(IL-4，IL-5，IL-13)的关系，同时为了评价参与调节应答的细胞因子(IL-10，TGF-β)的变化，我们对小鼠脾细胞上清的相关细胞因子进行了检测。结果发现，各组小鼠在感染P.berghei后，上述细胞因子的水平均开始增加并在第5天达到峰值。此外，混合感染可显著增高IL-4，IL-5，IL-13及TGF-β的水平，并显著降低前炎症因子INF-γ的水平，而IL-10的水平无明显变化。为了评价感染寄生虫的虫荷或数量改变对混合感染的影响，我们采用了两种虫荷的疟原虫和两种数量的血吸虫分别实行混合感染。结果表明，在感染低虫荷P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量可进一步增加IL-4，IL-5，IL-13及TGF-β的水平并进一步减少INF-γ的水平;反之，在感染高虫荷的P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量不能引起显著改变。　　结论：　　1、血吸虫混合感染可降低ECM死亡率及临床评分。感染低浓度P.berghei时，增加混合感染的血吸虫尾蚴数量能进一步降低ECM死亡率及临床评分。　　2、血吸虫混合感染降低了脑组织中CD8+T细胞的迁移，减低了BBB的通透性，降低了脑组织中与ECM相关的前炎症因子、趋化因子及粘附分子的mRNA表达。改变混合感染的两种寄生虫的虫荷/数量可引发相应改变，与ECM生存率的变化一致。　　3、血吸虫混合感染可抑制脾细胞中的DC应答，减低DC亚群数量，抑制DC成熟及Toll样受体的表达。改变混合感染中两种寄生虫的虫荷/数量可引起DC应答的不同变化。　　4、混合感染通过影响Tregs介导的免疫调节作用，使疟疾的Th1/Th2免疫应答向Th2应答偏移。改变混合感染中两种寄生虫的虫荷/数量可影响上述免疫调节应答及Th1/Th2免疫应答偏移程度。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号