陶厄氏菌Thauera sinica K11产邻苯二酚2,3-双加氧酶的发酵优化、分离提纯及性质表征

声明

第一章 绪论

1.1芳香族污染物的分类与治理

1.1.1芳香族污染物的分类

1.1.2芳香族污染物的治理

1.2 陶厄氏菌属（Thauera）

1.2.1Thauera属细菌的性质

1.2.2 Thauera 属细菌的功能

1.2.3 Thauera sinica K11 的性质研究

1.3邻苯二酚双加氧酶的研究进展

1.3.1邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构

1.3.2邻苯二酚2,3-双加氧酶作用机理

1.3.3邻苯二酚2,3-双加氧酶的来源

1.3.4邻苯二酚2,3-双加氧酶的应用

1.4微生物异源表达系统

1.4.1邻苯二酚2,3-双加氧酶的异源表达概述

1.4.2常见的异源表达系统

1.5本论文的研究内容及意义

第二章Thauera sinica K11 发酵培养基组分优化

2.1实验材料与仪器

2.1.1实验菌株

2.1.2药品试剂

2.1.3仪器设备

2.1.4实验用到的溶液

2.2实验方法

2.2.1 Thauera sinica K11 单因素实验设计

2.2.2 Thauera sinica K11的种子培养

2.2.3 Thauera sinica K11的发酵培养

2.2.4粗酶液的提取

2.2.5酶活力的测定与计算

2.3.6 Thauera sinica K11 Box-Behnken 响应面设计

2.3结果与讨论

2.3.1单因素实验结果

2.3.2 Box-Behnken 响应面实验结果

2.4本章小结

第三章 邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶学性质研究

3.1实验材料与仪器

3.1.1实验菌株

3.1.2药品试剂

3.1.3仪器设备

3.1.4实验常到的溶液

3.2实验方法

3.2.1邻苯二酚2,3双加氧酶的分离提取

3.2.2邻苯二酚2,3-双加氧酶分子量测定

3.2.3酶的粒径分析

3.2.4酶的二级结构测定

3.2.5酶活性中心金属离子的测定

3.2.6 pH对酶活的影响

3.2.7 pH值稳定性测定

3.2.8温度对酶活的影响

3.2.9 酶的热稳定性

3.2.10金属离子对酶活的影响

3.2.11酶的底物特异性

3.2.12溶氧对酶活的影响

3.2.13抑制剂对酶活的影响

3.2.14酶的Km值和Vmax测定

3.3实验结果与讨论

3.3.1邻苯二酚2,3双加氧酶的分离提取

3.3.2邻苯二酚2,3-双加氧酶分子量测定

3.3.3 酶的粒径分析

3.3.4酶的二级结构

3.3.5酶活性中心金属离子的测定

3.3.6最适pH值测定

3.3.7 pH稳定性

3.3.7温度对酶活的影响

3.3.8 酶的热稳定性

3.3.9金属离子对酶活的影响

3.3.10酶的底物特异性

3.3.11溶氧对酶活的影响

3.3.12抑制剂对酶活的影响

3.3.13酶的Km值和Vmax

3.4本章小结

第四章 邻苯二酚2,3-双加氧酶的异源表达与表征

4.1实验材料

4.1.1实验菌株

4.1.2药品试剂

4.1.3 实验仪器设备

4.1.4实验用到的溶液

4.2实验方法

4.2.1目的基因的PCR扩增

4.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

4.2.3目的基因的切胶回收

4.2.4质粒与DNA的双酶切

4.2.5目的片段与质粒的连接

4.2.6 E. coli DH5α感受态的制备

4.2.7 E. coli DH5α感受态的转化

4.2.8质粒DNA的提取

4.2.9制备含目的基因片段的重组菌株

4.2.10重组菌株E. coli BL21/pET28a(+)-C93O 的诱导表达

4.2.11重组邻苯二酚2,3-双加氧酶的分离提取

4.2.12重组邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶学性质研究

4.3实验结果

4.3.1重组质粒的鉴定

4.3.2重组菌株的基因测序

4.3.3重组邻苯二酚2,3-双加氧酶（C93O）的分离提取

4.3.4重组邻苯二酚2,3-双加氧酶（C93O）的分子结构

4.3.5 重组邻苯二酚2,3-双加氧酶（C93O）的最适反应条件

4.3.6 金属离子对重组邻苯二酚2,3-双加氧酶（C93O）的影响

4.3.7重组邻苯二酚2,3-双加氧酶（C93O）的底物特异性

4.3.8 邻苯二酚2,3-双加氧酶重组前后的性质比较

4.4本章小结

第五章 结论

参考文献

攻读硕士学位期间研究成果

致谢