全基因组外显子测序搜寻一例家族性进行性色素沉着和色素减退家系的致病基因

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研究背景：家族性进行性色素沉着和色素减退症（ familial progressive hyperpigmentation and hypopigmentation, FPHH）是一种外显率降低的常染色体显性遗传性色素异常性皮肤病，于1971年chernosky等人首次报道发现。临床特征为弥漫性不同程度的色素沉着、咖啡斑、较大桉树叶状色素减退斑，通常累及面、颈、躯干和四肢。患者出生时或出生几月后发病，皮损大小及数量随年龄增长而逐渐增加。有报道部分家系中患者存在智力缺陷和生长发育障碍。2011年Amyere等首次提出FPHH这个概念，并对7例伴雀斑样痣的FPHH家系（5例德国家系、1例美国家系和1例丹麦家系）进行全基因组参数与非参数多点连锁分析和单倍型分析，将其致病基因定位于染色体12q21.12-q22区域；其中4例家系中检测到 KITLG基因3种突变 c.107A>G（p.Asn36Ser）、c.98T>C（ p.Val33Ala）、c.100A>C（p.Thr34Pro）。
　　目的：（1）对1例常染色体显性遗传的汉族家族性进行性色素沉着和色素减退进行临床研究，探讨FPHH的临床特点。（2）进行KITLG基因突变检测，探讨是否由该基因引起该家系发病。（3）应用中华芯片进行连锁分析，确定致病基因的染色体定位。（4）选择该家系中1个患者和2个正常个体进行全基因组外显子测序，以搜寻该家系的致病基因，从而进一步阐明该家系发病分子遗传学机制。方法(1)对该家系中的所有患者进行遗传流行病学调查和体格检查。（2）采集家系中的14个样本（8例患者，6例正常对照）和200例家系外无血缘关系的正常个体对照外周抗凝血样本，采用Qiagen试剂盒提取所有样本的基因组DNA；（3）应用Primer Premier5.0软件对已报道的FPHH致病基因KITLG基因的全部外显子及其俩侧的侧翼序列区域进行引物设计，应用降落式 PCR扩增目的片段后，应用 ABI3730XL测序仪将所扩增目的片段进行 sanger直接测序验证有无致病突变。（4）使用Illumina中华芯片对获得DNA样本的家系中14名成员进行基因分型，获得的数据进行家系连锁定位分析，获得一段连锁区域。（5）HiSeq2500高通量测序仪对该家系2例正常对照（III:11，III:18）和1例患者（II:I0）进行全基因外显子测序，获得数据经过过滤、比对后，结果与连锁定位区域进行比对，选择处连锁定位区域内的变异位点进行Sanger测序验证。（6）如果未在连锁定位区域内找到变异位点或未在外显子组区域验证出基因型－表型共分离位点，应将搜索范围扩大到整个外显子组，通过功能预测软件如SIFT、PolyPhen选择可能有害变异位点，应用Sanger测序验证。
　　结果：（1）常染色体显性FPHH的临床特征出生时或出生几月后发病，皮损表现为弥漫性不同程度的色素沉着、咖啡斑、较大桉树叶状色素减退斑，通常累及面、颈、躯干和四肢，且皮损大小及数量随年龄增长而逐渐增加。（2）Sanger测序结果显示KITLG基因的所有外显子和侧翼序列未发现致病性突变。（3）Illumina中华芯片连锁分析未发现与该家系相连锁的染色体区域；（4）家系中的2例正常对照（III:11，III:18）和1例病例（II:I0）进行全基因组外显子测序，所获得的全部数据在dbSNP，Hapmap8等数据以及病例对照之间进行筛查，最终得到186个SNP位点和31个Indels变异。使用SIFT、Polyphen软件进行预测，获得22个可能有害的变异位点，Sanger测序未发现致病性突变。
　　结论：（1）在该FPHH家系中未有检测到KITLG基因致病性突变，提示FPHH存在遗传异质性。（2）应用Ilumina中华bread8芯片定位该FPHH家系连锁区域，并未得到有意义的连锁信号，推测该芯片适合大规模散发病例的连锁定位研究，不适合单基因小家系的研究。（3）应用全基因组外显子测序和Sanger测序未有发现该家系的致病基因，需要采用新的研究策略进行搜寻该家系的致病基因。

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作者
曾磊;
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作者单位

安徽医科大学;

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授予单位安徽医科大学;
学科皮肤病与性病学
授予学位硕士
导师姓名王培光;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R364.23;
关键词
常染色体显性色素异常性疾病; 色素沉着; 色素减退; 致病基因;

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