携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达

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目的：利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,为凋亡素VP3基因在治疗结肠癌方面的研究奠定基础。
　　方法：设计VP3 cDNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接构建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒,PCR和EcoRⅤ酶切电泳鉴定;穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP经Pmel酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,质粒经PCR、PacI酶切电泳及测序鉴定,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包装和扩增,采用CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及表达水平。
　　结果：pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒构建鉴定成功。线性化的pShuttle-VP3-hrGFP转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出了402bp的片段,重组质粒测序证实VP3-hrGFP编码区成功地克隆入了腺病毒pAd中,且其序列与GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu/ml,获得的重组腺病毒对SW480细胞的感染效率高于98％以上。
　　结论：用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并能在人结肠癌细胞中高效表达,为深入研究凋亡素VP3基因的抗肿瘤效应及探讨机制奠定了基础。

著录项

作者
胡茵;
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作者单位

安徽医科大学;

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授予单位安徽医科大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名胡春松;
年度 2014
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肿瘤病理生理学;
关键词
结肠癌; VP3基因; 重组腺病毒; SW480细胞; 凋亡素;

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