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血清肌红蛋白和心肌肌钙蛋白Ⅰ光激化学发光免疫测定法的建立

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前言

第一部分血清肌红蛋白光激化学发光免疫测定法的建立及评价

第二部分人心肌肌钙蛋白Ⅰ的提取、纯化及鉴定

第三部分血清cTnI光激化学发光免疫测定法的建立及评价

小结

参考文献

心肌肌钙蛋白I生物学特性、检测标准化和临床应用进展

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摘要

研究背景：急性心肌梗死(AMI)是严重危及人类生命的主要疾病之一，早期诊断有利于早期治疗进而减少患者的死亡率。诊断AMI的主要依据是特征性病史、心电图特异性变化和血清生化标志物的检测。大量临床实践发现，大约25％的AMI患者在发病早期没有典型的临床表现，只有大约50％的AMI患者出现特征性的心电图改变，这使得血清生化标志物的检测在AMI的诊断中具有重要作用。随着检测技术的改进和发展，心肌损伤血液生化标志物的检测已从酶活性检测发展到以蛋白质量为主的免疫检测。肌红蛋白(Mb)是目前公认的最合适有效的心肌损伤早期标志物，心肌细胞损伤后，血中Mb浓度的升高早于其他标志物，Mb阴性特别有助于排除AMI的诊断，如果在胸痛发作后4h№浓度没有升高，就可以基本排除AMI，Mb的这一特性十分有助于急性胸痛患者的快速分辩。心肌肌钙蛋白I(cTnI)对心肌损伤具有高度的敏感性和特异性，是目前最好的心肌损伤确定标志物。血清cTnI浓度于心肌损伤后4-12h升高并可持续7—10天。国内外有关学术团体都建议使用一个早期标志物和一个确定标志物进行联合检测用于AMI的诊断。因此，快速、可靠的Mb和cTnI免疫测定法的建立对AMI的诊断、治疗、预后判断等具有重要意义。 本研究分三个部分，第一部分：目的:采用光激化学发光免疫测定法(MCI)建立快速简便的血清Mb检测方法。方法:使用针对№不同表位的两株单克隆抗体，一株包被发光微粒，另一株进行生物素化，与包被有链霉亲合素的感光微粒共同构成检测试剂，优化检测条件并评价检测性能。结果:方法的分析灵敏度为L36ng／m1，在33．8-152lng／ml的范围内线性良好。批内和日间变异系数分别为3．28％一4．41％和5．80％～6．56％。在溶血(Hb<2．6g／L)、黄疸(BIL<20mg／d1)和脂血(TG<1000mg／d1)时对方法的干扰无临床意义。与RocheElecsys电化学发光法具有很好的相关性(r=O．9971)，两种方法检测结果的差异无显著性(P=-O．678)。方法在Mb浓度为3000ng／ml时无HOOK效应。男性组的平均Mb浓度显著高于女性组(39．21ng／mlvs28．ng/ml，P＜O．OD，男性和女性的参考范围(2．5—97．5百分位值)分别为9．64—86．18ng／m1和6．49—65．85ng／m1。MbLICI的主要试剂在4℃条件下5周内具有较好的稳定性。第二部分：目的:从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白I。方法:首先采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C(TnC)，然后制备连接有Tnt的亲和层析介质，通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用SDS-PAGE和WesternBlotting进行鉴定。结果:从10g人心肌组织中共提纯2．44mgcTnI，SDS—PAGE电泳图上显示为单一条带，表观分子量约为29KDa。WesternBlotting结果表明单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI，纯化的cTnI的SDS—PAGE和WesternBlotting结果均与Sigma公司的cTnI结果一致。第三部分：目的:采用LICI建立血清cTnI的定量检测方法。方法:使用两株特异性的cTnI单克隆抗体，一株包被发光微粒，另一株进行生物素化，与包被有链霉亲合素的感光微粒共同构成检测试剂，优化检测条件并评价检测性能。结果:方法的分析灵敏度为0．05ng/m1，在L101-29．36ng／m1的范围内线性良好。批内和日间变异系数分别为4．89％一5．93％和6．76％一8．96％。与BiocheckcTnIELISA具有较好的相关性(r=O．964)，方法在cTnI浓度为161ng／ml时无HOOK效应。cTnILICI试剂在4℃条件下3周内具有较好的稳定性。结论:采用LICl分别建立了血清Mb和cTnI的定量检测方法，我们正在继续改进和完善方法的检测性能。总之，该方法简便快速，与国外试剂相比成本较低，符合我国医疗实际。本研究的结果为进一步的AMI诊断试剂盒的研制打下了基础。

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