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复方芪参提取物体外抗瘢痕疙瘩作用及其作用机制

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1 前言

2 材料与方法2.1 材料

2.1.1 细胞

2.1.2 试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4主要溶剂配制

2.2方法

2.2.1建立KFs及NFs细胞系

2.2.2 MTT法检测CASE 对KFs增殖的影响

2.2.3 3H-脯氨酸掺入法检测CASE对KFs胶原的抑制作用

2.2.4 Transwell小室法检测CASE对KFs侵袭的抑制作用

2.2.5 细胞免疫荧光染色法观察CASE对TGF-β1诱导的KFs内Smad2和Smad3(包括连接区和C末端)蛋白磷酸化的抑制作用,人体正常成纤维细胞(NFs)做对照

2.3检测方法

2.3.1 MTT法

2.3.2 3H-脯氨酸掺入法

2.3.3 Transwell小室法

2.3.4 细胞免疫荧光染色法

2.3.5 数据处理 数据用x ± s表示,各组均数之间比较采用SPSS 10.0统计软件进

3 结果3.1 建立KFs及NFs细胞系

3.2 CASE 对KFs增殖的影响

3.2.1 CASE 对NBS刺激的KFs增殖抑制作用

3.2.2 CASE 对TGF-β1诱导的KFs增殖的影响

3.3 CASE对KFs胶原合成的抑制作用

3.3.1 TGF-β1对NFs胶原合成的影响

3.3.2 CASE对NBS刺激的KFs胶原合成的抑制作用

3.3.3 CASE对TGF-β1(40 pmol·L-1)刺激的KFs胶原合成的抑制作用

3.4 CASE对KFs侵袭的影响

3.4.1 CASE对NBS刺激的KFs侵袭的抑制作用

3.4.2 CASE对TGF-β1刺激的KFs侵袭的抑制作用

3.5 CASE对TGF-β1诱导的KFs内Smad2/3连接区蛋白磷酸化的抑制作用

3.5.1 CASE对TGF-β1诱导的KFs胞内pSmad2L及pSmad3L蛋白表达的影响

3.5.2 CASE对TGF-β1诱导的NFs胞内pSmad2L及pSmad3L蛋白表达的影响

4 讨论

5.结论

参考文献

附录

致谢

综述

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摘要

瘢痕疙瘩是一种以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分,尤其是胶原组织过度沉积导致的纤维增生性疾病。目前研究认为转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)是瘢痕疙瘩最关键的致病因子,能刺激成纤维细胞增殖及合成胶原,从而导致ECM沉积及纤维化。对于瘢痕疙瘩的发病机制,已有研究表明TGF-β1/Smad信号途径起重要作用,近些年来,对于瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFs)内磷酸化Smad蛋白的研究很多,但大多数仅仅局限于经由TβRI途径的C末端磷酸化的研究。本课题组已经报道了TGF-β1不仅能够诱导KFs内Smad蛋白C末端的磷酸化,而且还证实TGF-β1对Smad蛋白连接区的磷酸化具有高度的诱导作用,初步确认Smad蛋白连接区为瘢痕疙瘩的发生发展过程中的关键位点。
  前期研究已经报道复方芪参提取物(compound astragalus and salvia miltiorrhiza extracts,CASE)通过干扰TGF-β1/Smad信号途径,发挥其抗肝纤维化作用,并且抑制HepG2细胞的增殖。为探讨CASE对TGF-β1诱导的KFs的增殖,胶原合成以及侵袭能力的影响,以及CASE对TGF-β1诱导的KFs内Smad蛋白连接区域磷酸化的影响,分别采用MTT,3H-脯氨酸掺入,Transwell小室,细胞免疫荧光染色方法,结果如下:
  1.CASE抑制血清诱导的KFs增殖
  CASE(15~60 mg·L-1)能够呈浓度依赖性地抑制10%血清(new bovine serum, NBS)所刺激的KFs增殖。 CASE的半抑制浓度(IC50)为18.90 mg·L-1。
  2.CASE对KFs胶原合成的抑制作用
  TGF~β1(40 pmol·L-1)与15%NBS均可刺激KFs胶原的合成。CASE(3.75~60 mg·L-1)不仅呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的KFs胶原合成,而且CASE(7.5~60 mg·L-1)可抑制血清所刺激的KFs胶原合成。CASE对NBS及TGF-β1诱导的KFs胶原合成的IC50分别为6.49 mg·L-1和4.20 mg·L-1。
  3.CASE对KFs侵袭能力的抑制作用
  TGF-β1(40 pmol·L-1)与15%NBS分别能明显增强KFs的侵袭能力。CASE(7.5~30 mg·L-1)显著抑制TGF-β1增强的侵袭能力,CASE(15~30 mg·L-1)显著抑制NBS增强的侵袭能力。CASE对NBS及TGF-β1诱导的KFs侵袭能力的IC50分别为19.70 mg·L-1和12.37 mg·L-1。而CASE与TGF-β1对NFs的侵袭能力均无明显影响。
  4.CASE对TGF-β1诱导的KFs内pSmad2L和pSmad3L蛋白表达的抑制作用
  经采用细胞免疫荧光染色法检测的结果显示:TGF-β1(40 pmol·L-1)能够使pSmad2L及pSmad3L蛋白表达明显增加,同时能刺激其转位入核;CASE(7.5~30 mg·L-1)不但明显抑制TGF-β1诱导的KFs细胞pSmad2L及pSmad3L磷酸化蛋白的表达增加,而且能够抑制其转位入核。TGF-β1与CASE对NFs内Smad2/3蛋白磷酸化均无明显影响。
  综上所述,CASE具有明显抑制 KFs的增殖、胶原合成及其侵袭能力,明显抑制TGF-β1诱导的KFs内Smad2/3蛋白连接区磷酸化,提示,CASE可能通过干扰TGF-β1/Smad信号途径而发挥其体外抗瘢痕疙瘩的作用。

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