一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法

技术领域

本发明属于植物药对研究技术领域，特别是涉及到体外药效学结合网络药理学和分子对接技术研究及探索人参-桑椹药对骨质疏松症的机制。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨代谢紊乱、微结构损坏为主要特征, 并且由于骨量流失及强度降低,日后容易并发主要部位的脆性骨折。OP的发病率随着人口老龄化的加重而逐年上升。现在它已经成为世界上第七大最常见的疾病。研究显示,中药及其复方具有整体调节作用，激素水平得到调节，机体免疫力得到提高，促进骨密度增加，改善和修复受损的小梁骨微结构，治疗OP患者的疾病。它在预防和治疗OP方面具有较高的安全性和独特的优势，但其具体作用机制尚不清楚。随着网络药理学的发展和应用，从靶向生物信号网络的角度进行深入分析，对中医药防治OP的研究领域具有重要意义。《素问·痿论篇》曰:“肾主骨之骨髓”肾藏精,精生髓,髓居于骨腔中,以滋养骨骼,当肾精亏虚时,则骨枯髓减。因此，肾虚是骨质疏松症的主要病因，而肾精的升降决定了骨的强弱，因此补肾中药被广泛应用于骨质疏松症的防治。人参为五加科植物(Panax ginseng C.A.Mey)。2020版药典记载人参具有大补元气，强精补肾之功效。桑椹为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥果穗。2020版药典记载归心、肝、肾精。具有治疗肝肾阴虚，关节不利，滋阴补血之功效。中医认为，肾藏精，精生髓，髓养骨。从生理上讲，肾脏储蓄先天的精华，可以转化为骨髓。骨髓储存在骨头里，骨髓充实则骨骼生长强硬；病理上，肾精亏虚，骨髓不足，骨质流失，导致各种骨病。近年来，大量研究表明人参和桑椹都具有治疗骨质疏松的作用，但目前主要集中于单味药治疗骨质疏松的研究，二者联合用药后治疗骨质疏松的研究未见报道。

自2008年发出以来，网络药理学成为一门新兴学科，在调控水平上揭示了中药在人体调节网络中的作用。由于其整体，系统的研究方法以及药物与中药的多靶点，多病理特征共同作用的特点，已成为系统分析多靶点，多路径机制的有效工具。多项研究利用网络药理学探索中药作用机制已经取得成功。因此，现有技术中亟需一种采用细胞实验并结合网络药理学方法，探究人参、桑椹单味药及药对配伍的不同极性组分治疗骨质疏松作用的效果及其分子机制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，通过体外药效学结合网络药理学以及分子对接技术，验证人参-桑椹对骨质疏松症作用机制，将体外药效学试验结果与网络药理学获得的关键靶点及通路相对应，确定具体潜在药效物质及其分子机制，为其后续开发应用提供参考。

一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、取人参单味药、桑椹单味药以及人参-桑椹联合药，分别加10倍量水以及8倍量乙醇，浸泡0.5h，提取2次，每次提取1h及2h，合并2次滤液，得到人参水提液GW、桑椹水提液MW、人参醇提液GC、桑椹醇提液MC、人参和桑椹水提物配伍GMW、人参和桑椹醇提物配伍GMC，减压浓缩制成干膏，置4℃冰箱保存待用；

步骤二、取骨细胞MC3T3-E1和睾丸间质细胞TM3，在37℃恒温条件下，5％CO2 培养箱中培养含10％胎牛血清和MEM培养基的细胞，细胞贴壁后取出培养基，用 PBS洗涤三次至无漂浮细胞；再次加入培养基继续培养；当细胞被80％～90％覆盖时，用0.25％胰蛋白酶传代，每2～3天传代一次；取对数生长期细胞待用；

步骤三、将步骤一获得的六种药液分别对睾丸间质细胞TM3进行细胞增殖试验和睾酮分泌的影响试验，对骨细胞MC3T3-E1进行细胞增殖试验和细胞分化试验；

步骤四、在数据库TCMSP中查询人参-桑椹化学成分，筛选生物利用度 OB≥30％，类药性DL≥0.18的活性成分，并收集相关靶点，构件成分靶点网络图，分析网络拓扑参数，获得关键节点；

步骤五、在GeneCards数据库，OMIM数据库收集骨质疏松症相关靶点，通过Uniprot数据库将靶点转换为Uniprot Entry格式，应用Venn工具将步骤四的关键节点与骨质酥松症相关靶点取交集，得到人参-桑椹药对治疗骨质疏松症关键靶点；

步骤六、将步骤五获得的关键靶点导入蛋白质相互作用分析数据库STRING，分析关键靶点间的蛋白相互作用，利用DAVID数据库进行生物功能和通路分析，构建成分-靶点-通路网络图；

步骤七、采用Autodock软件对潜在药效物质和关键靶点进行分子对接；通过Pymol三维分子模拟软件对活性化合物结果进行可视化处理，获得蛋白对接模式图，获得。

所述步骤三睾丸间质细胞TM3进行细胞增殖试验和睾酮分泌的影响试验为，将步骤一获得的六种浓缩干膏分别溶于少量二甲基亚砜中，用培养基稀释成 12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml，对照组加入相同体积的培养基；将步骤二对数生长的TM3细胞接种于96孔板中，每孔加入200μL 细胞悬液，每组5复孔；培养24小时后，丢弃培养基，分别加入不同浓度样品和对照组的3.125μmol/lH2O2溶液；培养24小时后，收集细胞上清进行睾酮检测；每孔加入5mg/mL MTT染色剂，37℃暗孵4h，于490nm处检测；根据吸光度计算各组细胞增殖率和睾酮分泌量。

所述步骤三骨细胞MC3T3-E1进行细胞增殖试验和细胞分化试验为，骨细胞MC3T3-E1接种于96孔板中，24h后加入不同浓度的样品，使各组的终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml，每组5个复孔；将其置于37℃的5％CO

用ELISA酶吸附法检测细胞ALP活力；以加入成骨诱导培养基地塞米松0.1 μM作为模型对照组，以人参和桑椹水提物配伍GMW和人参和桑椹醇提物配伍 GMC作为给药组，MC3T3-E1细胞为空白对照组；将细胞转移到12孔板并培养24h 后加入不同浓度的样品，使各组的终浓度分别为12.5μg/mL、25μg/mL、50 μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；24小时后，进行检测。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，通过体外药效学结合网络药理学以及分子对接技术，验证人参-桑椹对骨质疏松症作用机制，将体外药效学试验结果与网络药理学获得的关键靶点及通路相对应，确定具体潜在药效物质及其分子机制，为其后续开发应用提供参考。

进一步的，通过体外药效学结合网络药理学和分子对接技术研究人参、桑椹单味药及药对不同极性组分对小鼠睾丸间质细胞TM3增值率及睾酮分泌影响和药对不同极性组分对成骨细胞MC3T3-E1增值率及碱性磷酸酶ALP活力的影响；通过中药成分数据库TCMSP、GeneCards、OMIM数据库分别收集人参、桑椹化学成分，成分及疾病相关靶点，两者取交集后，运用STRING数据库分析关键靶点间的蛋白相互作用，利用DAVID数据库进行生物功能和通路分析；相关结果采用Cytoscape 3.7.0进行构图和网络拓扑结构分析；并应用Autodock软件对潜在药效物质和关键靶点进行分子对接。经过TM3给药组与模型对照组比较，药对各浓度细胞增殖率明显高于单味药各浓度值，且呈浓度依赖性，其中浓度 200μg/mL时增值率最高，增值率分别是97.31％、91.67％(P<0.01)，睾酮分泌量分别是3.48ng/mL、3.06ng/mL(P<0.01)。MC3T3-E1给药组与空白对照组比较，细胞增殖率明显升高；在药对水提物给药组中200μg/mL浓度细胞增殖率最高，增殖率为155％(P<0.01)；醇提物给药组中100μg/mL时细胞增值率最高，增值率为142.8％(P<0.01)；ALP分析结果显示药对水提物给药组及醇提物组均具有明显升高效果。本研究共收集到28个活性成分，69个关键靶点，GO功能富集收集到257个生物过程，34个分子功能，62个细胞组分；KEGG通路富集共收集到109条通路；分子对接结果显示，潜在药效物质与关键靶点IL6、ALB、 MAPK8、CASP3对接结果能量低于0kcal/mol。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法体外药效学试验人参和桑椹水提物配伍GMW和人参和桑椹醇提物配伍GMC对睾丸间质细胞TM3 细胞睾酮分泌量影响的柱形示意图。

图2为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法体外药效学试验人参和桑椹水提物配伍GMW和人参和桑椹醇提物配伍GMC对骨细胞MC3T3-E1 细胞增殖率影响的柱形示意图。

图3为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法体外药效学试验人参和桑椹水提物配伍GMW和人参和桑椹醇提物配伍GMC对骨细胞MC3T3-E1 碱性磷酸酶ALP活力影响的柱形示意图。

图4为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学获取人参-桑椹药对活性成分-靶点网络图。

图5为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学关键靶点PPI网络图。

图6为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学GO 功能富集示意图Ⅰ。

图7为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学GO 功能富集示意图Ⅱ。

图8为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学GO 功能富集示意图Ⅲ。

图9为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学 KEGG通路富集示意图。

图10为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学活性成分-靶点-通路网路图。

图11为本发明一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法网络药理学活性成分与CASP3、ALB、IL6、MAPK8的分子对接模式图。

具体实施方式

一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，包括体外药效学分析，网络药理学分析，以及分子对接技术分析；

具体的，

体外药效学分析

取人参单味药、桑椹单味药以及人参-桑椹联合药，分别加10倍量水以及8 倍量乙醇，浸泡0.5h，提取2次，每次提取1h及2h，合并2次滤液，得到人参水提液GW(简称GW)、桑椹水提液MW(简称MW)、人参醇提液GC(简称GC)、桑椹醇提液MC(简称MC)、人参和桑椹水提物配伍GMW(简称GMW)、人参和桑椹醇提物配伍GMC(简称GMC)，减压浓缩制成干膏，置4℃冰箱保存待用。

取骨细胞MC3T3-E1(简称MC3T3-E1细胞)和睾丸间质细胞TM3(简称TM3 细胞)，在37℃恒温条件下，5％CO2培养箱中培养含10％胎牛血清和MEM培养基的细胞，细胞贴壁后取出培养基，用PBS洗涤三次至无漂浮细胞；再次加入培养基继续培养；当细胞被80％～90％覆盖时，用0.25％胰蛋白酶传代，每2～3天传代一次；取对数生长期细胞待用。

六种药液分别对睾丸间质细胞TM3进行细胞增殖试验和睾酮分泌的影响试验，

实验分为给药组、对照组和空白组。将单药及其不同组分溶于少量二甲基亚砜中，用培养基稀释成12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和 200μg/ml，对照组加入相同体积的培养基α-MEM(含L-谷氨酰胺和核苷)。将 TM3细胞接种于96孔板中，每孔加入200μL细胞悬液(4×103细胞/孔)，每组5复孔。培养24小时后，丢弃培养基，分别加入不同浓度样品和对照组的 3.125μmol/lH2O2溶液。培养24小时后，收集细胞上清进行睾酮检测。每孔加入MTT(5mg/mL)，37℃暗孵4h，于490nm处检测。根据吸光度计算各组细胞增殖率和睾酮分泌量。

六种药液分别对对骨细胞MC3T3-E1进行细胞增殖试验和细胞分化试验，

MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，24h后加入不同浓度的样品，使各组的终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml。每组 5个复孔。将其置于37℃的5％CO2培养箱中连续培养。24h后，每孔加入MTT (5mg/mL)试剂，37℃暗孵4h。根据测定的吸光度，计算各组细胞增殖率。用 ELISA法检测细胞ALP活力。以加入成骨诱导培养基地塞米松(0.1μM)作为模型对照组，以GMW和GMC作为给药组，MC3T3-E1细胞为空白对照组。将细胞转移到12孔板并培养24h后加入不同浓度的样品，使各组的终浓度分别为12.5 μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。24小时后，进行检测。具体方法按照BCA法蛋白定量试剂盒说明及ALP试剂盒说明操作进行测定。

如表1所示与空白对照组比较，模型对照组睾丸间质细胞增值率明显降低 (P<0.01),表明小鼠肾衰模型建立成功。与模型对照组比较，GW、MW、GMW、 GC、MC、GMC组增值率明显升高(P<0.05,P<0.01),并且呈浓度依赖性。GMW、 GMC的增值率明显高于GW、MW、GC、MC的增值率(P<0.05,P<0.01)。

表1、单味药及药对不同组分对小鼠睾丸间质细胞具有一定的增殖活性的作用(

由图1所示，与空白对照组比较模型对照组睾酮分泌明显降低(P<0.01), 表明小鼠肾衰模型建立成功。与模型对照组比较，GMW、GMC组睾酮分泌明显升高(P<0.05,P<0.01),并且呈浓度依赖性。

由图2所示，与空白对照组比较，GMW、GMC组的细胞增殖率明显升高(P<0.05, P<0.01)。在GMW组中200μg/mL浓度的细胞增殖率明显高于其他浓度(P<0.01)。 GMC组中100μg/mL浓度的细胞，增值率明显高于其他浓度(P<0.01)。

由图3所示，与空白对照组比较，模型对照组ALP活力明显减低(P<0.01)。与模型对照组比较，GMW、GMC组的ALP活力明显升高(P<0.05,P<0.01)。GMW 中25μg/mL浓度时ALP活力明显高于其他浓度ALP活力(P<0.01)。GMC中 200μg/mL浓度时ALP活力明显高于其他浓度ALP活力(P<0.01)。

网络药理学分析

通过检索TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，以“人参”、“桑椹”、“RenShen”、“SangShen”为关键词，在TCMSP数据库检索到人参化学成分190种，桑椹中化学成分91种；并以生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30％，类药性(drug-likeness,DL)≥0.18作为吸收、分布、代谢、排泄参数筛选出活性成分，人参中筛选出活性成分22种，桑椹中活性成分6种，其中两者共有活性成分28种，见表2。并获得活性成分相关作用靶点99个。利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库将收集到的靶点转换为UniprotEntry格式，将28种活性成分与中所得到的交集69个关键靶点通过Cytoscape 3.7.0软件构建“活性成分-靶点”网络，见图4。图中共有节点(Node)97个，边(Edge)137条，四边形节点为人参-桑椹两者共有成分，三角形节点为靶标蛋白。通过分析网络性质，活性成分M04,M14,M16, M27,M28的度值(Degree)高于平均值，M04,M14,M16是人参的活性成分，M27, M28是桑椹的活性成分，说明这些成分可能是人参-桑椹治疗骨质疏松症关键成分。

表2人参-桑椹中活性化合物的基本信息

通过检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)输入关键词“Osteoporosis”收集骨质酥松症相关靶点；并通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库将靶点转换为 Uniprot Entry格式。删除重复项后得获骨质疏松症相关靶点4204个，应用Venn 工具(http://www.Venn.org/)将活性成分作用靶点与骨质酥松症相关靶点取交集，与活性成分相关靶点取交集后共获得69个关键靶点。

将69个关键靶点，导入STRING数据库(https://string-db.org/)，基因类型改为“Homo sapiens”，并将置信度设置为medium confidence 0.400，获得PPI网络图TSV格式文件，将其导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化处理，其中有4个蛋白没有互作关系，见图5。图5中共涉及65个节点(Node)， 638条边(Edge)。PPI网路图中，节点颜色从浅色渐变至深色表示Closeness Centrality从小到大变化。共有30个蛋白度值高于平均值(19.6)，见表3，其中度值前五的蛋白为IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3说明这5种蛋白在网络中与其他蛋白相互作用较多，在网络中发挥了重要作用。

表3 30个关键靶蛋白

将关键靶点输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.05为条件共收集到257个生物过程 (biologicalprocess)，34个分子功能(cell compound)，62个细胞组分 (molecular function)和109条KEGG通路，将GO功能富集排名前30的生物过程、分子功能、细胞组分及前20的KEGG通路绘图从数据库导出。见图6～图 9。所包含基因数最多的前20的通路详细信息结果，见表4。将DAVID分析结果导入Cytoscape 3.7.0构建“活性成分-靶点-通路”网络图，见图10。图中菱形节点为两者共有成分，四边形节点为关键靶标蛋白，长方形为通路。共有117 个节点，406个边，平均Degree值为6.719(该值是表示与该节点相连的边的条数，节点度越高，其参与的生物过程越多)，≥6.719的有44个，其介数 (Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)、平均最短路径长度(Average Shortest Path Length)表明了其重要性，网络拓扑参数，见表5。由此可知，相同成分可对应一个或多个靶点，而不同成分又可作用于同一靶点，具有协同作用。

表4基因数目前20的KEGG通路基本信息

表5网络拓扑参数

分子对接技术验证

通过检索TCMSP数据库获得活性成分*MOL2格式化学结构，再利用Pubchem数据库(https://www.pubchem.org/)转换为PDB格式。检索RCSB PDB数据库 (http://www.rcsb.org/)获得蛋白晶体结构，利用Autodock软件，进行去水、加氢等操作后保存为PDB格式，选取“活性成分-靶点-通路”网络图中度值高于平均值的四个化合物(kaempferol、quercetin、beta-carotene、 beta-sitosterol)与PPI网络中度值排名前四的靶点(CASP3、ALB、IL6、MAPK8) 进行对接，除beta-carotene与靶点对接后bindingenergy大于0kcal/mol外，其余结果均小于0kcal/mol，说明活性成分和靶蛋白能形成较为稳定的结合。利用Pymol软件对活性化合物结果进行可视化处理结果，见图11。A,B,C分别为kaempferol、quercetin、beta-sitosterol与CASP3蛋白对接模式图。