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海蜇多糖的分离纯化、结构鉴定及免疫活性研究

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第一章 前言

1.1 水母的分类

1.2 海蜇的形态结构

1.3 海蜇生物活性物质研究

1.3.1 水母毒素

1.3.2 多糖

1.3.3 糖蛋白

1.3.4 胶原蛋白

1.3.5 活性肽

1.3.6 甾醇

1.4 课题研究的目的意义与研究内容

1.4.1 课题研究的目的意义

1.4.2 课题研究内容

第二章.材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要试剂

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

2.4.1 海蜇多糖的提取

2.4.2 海蜇多糖的分离纯化

2.4.3 海蜇多糖均一组分JSP11的理化性质分析

2.4.4 海蜇多糖均一组分JSP11的结构解析

2.4.5 海蜇多糖均一组分JSP11的免疫调节活性

2.5 统计学分析

第三章 结果与分析

3.1 海蜇多糖的提取、分离和纯化

3.2 海蜇多糖均一组分JSP11的理化性质分析

3.3 海蜇多糖均一组分JSP11的结构解析

3.3.1 红外光谱分析

3.3.2 单糖组成分析

3.3.3 甲基化分析

3.3.4 核磁共振分析

3.4 海蜇多糖均一组分JSP11的免疫活性研究

3.4.1 JSP11对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响

3.4.2 JSP11对RAW264.7巨噬细胞分泌NO、TNT-α和IL-1β的影响

3.4.3 JSP11中LPS污染的检测

3.4.4 JSP11对iNOs、TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响

3.4.5 JSP11对RAW264.7巨噬细胞中NF-κB信号通路蛋白表达的影响

3.4.6 JSP11对RAW264.7巨噬细胞中MAPKs信号通路蛋白表达的影响

3.4.7 JSP11对RAW264.7巨噬细胞中PDK/Akt信号通路蛋白表达的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

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摘要

海蜇是一种药食两用的海洋生物,是我国传统渔业生产的主要大型食用水母。研究表明,多糖是海蜇的主要活性物质之一。本课题组前期的研究发现海蜇粗多糖具有免疫调节活性,本文以此为基础,以海蜇为原材料,重点开展了海蜇多糖的提取、分离纯化、结构鉴定和免疫活性方面的研究,主要实验结果如下:
  (1)海蜇经水提醇沉获得总多糖,利用DEAE Cellulose DE52离子交换层析和Sephacryl S-500凝胶渗透色谱柱对总多糖进行分离纯化,获得一种均一组分海蜇多糖JSP11,相对分子质量为1.25×106 Da。
  (2)单糖组成分析显示,JSP11是由甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成,其分子摩尔比为2.18∶1.00∶1.94。甲基化实验结果表明,JSP11包含1,3,6-Manp、1,6-Galp和1-GlcpA三种糖苷键连接方式,各糖残基的组成摩尔比为1.98∶1.00∶2.03。依据JSP11的基本结构特征,并结合NMR分析的结果,对JSP11中单糖残基的C、H化学位移进行了归属,并对不同糖苷键的连接顺序进行了确证。
  (3) MTT实验结果说明在10~200μg/mL浓度范围内,JSP11能促进RAW264.7巨噬细胞的生长,无细胞毒性。NO和细胞因子的含量分析显示,JSP11在10~200μg/mL浓度范围内能促进RAW264.7巨噬细胞产生NO、TNF-α和IL-1β,且呈剂量依赖性,当JSP11剂量达到200μg/mL时,NO、TNF-α和IL-1β的产生量分别比对照组提高了140%、77%和53.8%,表明JSP11具有免疫调节活性。PMB屏蔽实验证明JSP11未受LPS的污染。荧光定量RT-PCR实验表明,JSP11能诱导iNOS、TNF-α和IL-1β mRNA在RAW264.7细胞中的表达,且呈量效关系。Western Blot实验结果表明,JSP11促进NF-κB p65的核移位,与对照组相比,多糖处理组p-P38、p-ERK1/2、p-JNK和p-Akt的蛋白表达量明显提高,说明JSP11能通过NF-κB、MAPKs和PI3K/Akt信号通路激活RAW264.7巨噬细胞。

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