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STAT3介导CX3CL1上调在SMIR诱导术后慢性疼痛中的作用及机制研究

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摘要

缩略词表

前言

一、材料

(一)实验动物

(二)主要抗体和试剂

(三)主要试剂的配置

(四)主要仪器

二、方法

(一)SMIR模型建立

(二)鞘内置管及给药

(三)50％机械撤足阈值测试

(四)用于PCR及western blot的脊髓取材

(五)实时定量PCR检测

(六)Western blot蛋白质印迹法检测

(七)免疫荧光组织化学

(八)染色质免疫共沉淀

(九)统计分析

三、实验结果

(一)脊髓背角CX3CL1上调参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏

(二)STAT3介导了SMIR诱导的脊髓背角CX3CL1的上调和机械性痛觉过敏

(三)SMIR可促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域结合

四、讨论

五、小结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢

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摘要

目的:　　外科手术后常常继发术后慢性疼痛，严重影响患者的生活质量。近年来研究显示，CX3CL1在神经损伤引起的神经病理性疼痛中发挥重要作用，然而CX3CL1是否参与术后慢性疼痛并不清楚。本研究采用大鼠皮肤肌肉切口牵拉(skin/muscle mcision and retraction，SMIR)模型模拟术后慢性疼痛，探讨CX3CL1是否参与SMIR诱导的痛觉过敏以及其机制。　　方法:　　一、研究SMIR术后大鼠脊髓背角CX3CL1表达情况及CX3CL1是否参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏　　首先行SMIR术并检测SMIR术前及术后第1、5、10、20天大鼠手术同侧和对侧的50％机械撤足阈值(paw withdrawal threshold，PWT);SMIR术前30mm直至术后第10天每天一次或SMIR术10天后已产生显著机械性痛觉过敏的情况下再连续5天每天一次鞘内注射CX3CL1中和性抗体，分别检测大鼠术侧PWT变化;分别取空白对照组、SMIR术后第1、5、10、20天大鼠术侧脊髓背角，进行western blot和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测CX3CL1的蛋白和mRNA表达水平;分别取空白对照组、单纯SMIR组及SMIR+CX3CL1antibody组大鼠脊髓，免疫荧光检测小胶质细胞标记物Iba1在脊髓背角的荧光信号强度;SMIR术后第10天取大鼠脊髓，免疫荧光检测CX3CL1在脊髓背角的表达部位。　　二、检测SMIR是否激活大鼠脊髓背角STAT3及STAT3是否介导了CX3CL1的上调和痛觉过敏　　SMIR术后第10天取大鼠脊髓，免疫荧光检测p-STAT3在脊髓背角的表达部位以及CX3CL1和p-STAT3是否存在共定位;分别取空白对照组、SMIR术后第1、5、10、20天大鼠术侧脊髓背角，进行western blot检测总的STAT3和p-STAT3的蛋白表达水平;SMIR术前30min至术后第10天，每天一次鞘内注射STAT3磷酸化抑制剂S3I-201，检测大鼠术侧PWT变化;将大鼠分为三组，一组为空白对照组，一组单纯行SMIR手术，还有一组行SMIR手术且预先鞘内注射S3I-201直至术后第10天，western blot检测三组大鼠术侧脊髓背角p-STAT3和CX3CL1的蛋白表达水平，qPCR检测三组大鼠术侧脊髓背角CX3CL1mRNA表达水平。　　三、探讨SMIR是否促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合　　将大鼠分为SMIR组和空白对照组，对术侧脊髓背角进行染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验，用STAT3抗体将可能与之结合的DNA片段拉下来，再进行实时荧光定量PCR和半定量PCR检测。　　结果:　　一、脊髓背角CX3CL1上调参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏　　SMIR术后第5天开始出现显著的机械性痛觉过敏并维持到术后第20天。预先鞘内注射CX3CL1中和性抗体能显著缓解SMIR诱导的机械性痛觉过敏，而对SMIR术后已产生显著机械性痛觉过敏的大鼠再鞘内注射CX3CL1中和性抗体则不能缓解已产生的痛觉过敏。SMIR术后第5、10、20天，术侧脊髓背角CX3CL1蛋白和mRNA表达水平与空白对照组相比显著上调。免疫组化结果显示，SMIR显著激活脊髓背角小胶质细胞，而鞘内注射CX3CL1中和性抗体能抑制小胶质细胞的激活。且SMIR术后，脊髓背角上调的CX3CL1表达在脊髓背角神经元上但不表达在星形胶质细胞和小胶质细胞上。　　二、STAT3介导了SMIR诱导的脊髓背角CX3CL1的上调和机械性痛觉过敏　　SMIR术后，p-STAT3也主要表达在脊髓背角神经元上但不表达在星形胶质细胞和小胶质细胞上，且CX3CL1和p-STAT3存在大量共定位。SMIR术后第5、10、20天，术侧脊髓背角STAT3磷酸化水平显著上调。预先鞘内注射STAT3磷酸化抑制剂S3I-201能显著缓解SMIR诱导的机械性痛觉过敏，并能抑制SMIR术后脊髓背角p-STAT3和CX3CL1蛋白水平的上调，CX3CL1在mRNA水平的上调同样受到抑制。　　三、SMIR可促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合　　和空白对照组相比，ChIP结果表明SMIR可促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合。　　结论:　　SMIR术后，大鼠脊髓背角CX3CL1上调并参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏，STAT3激活并介导了CX3CL1的上调和痛觉过敏，这可能是由于SMIR上调了STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合进而促进了CX3CL1的转录。

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