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受激拉曼散射显微镜的髓鞘成像应用及连续波激光器搭建受激拉曼散射显微镜

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基于相干反斯托克斯拉曼散射(coherent ani-Stokes Raman scattering，CARS)和受激拉曼散射(stimulated Raman scattering，SRS)现象的相干拉曼散射成像技术，不需要额外染料分子或荧光蛋白标记，针对特定的化学键振动进行成像，具有非侵入性的优点，在生物学和医学成像领域有着非常重要的作用。经过二十年的发展，相干拉曼散射显微镜被广泛应用于生命科学和生物医学成像领域。分子振动成像赋予相干拉曼散射显微镜探测分子信息的优势，更便于检测疾病组织中分子组成成分的变化。病变组织分子组成成分为诊断疾病发生提供了重要信息，而相干拉曼散射显微镜正是探测这一过程最用力的工具。
　　髓鞘是神经系统最重要的组成成分之一，它保证动作电位沿着神经轴突以跳跃式传导方式传播，确保神经信号在长距离下快速高效的传导能力。髓鞘的发育和成熟，是神经系统正常工作的基础，因而髓鞘发育和成熟的研究对我们理解大脑的工作机制具有重要意义。在髓鞘相关疾病中，损伤的髓鞘妨碍或阻止了神经信号的传导，导致感觉、运动、认知等功能的障碍和缺陷，严重影响人类的正常生理健康和生活质量。因此脱髓鞘和髓鞘再生被广泛研究，以寻求能够治疗脱髓鞘疾病的方案和策略。目前研究髓鞘的成像手段有电子显微镜、经典组织形态学、荧光显微镜和核磁共振成像。电子显微镜的超高分辨率揭示了髓鞘的超微结构，为我们理解髓鞘提供了结构基础;组织形态学在形态学水平上为诊断正常和病变髓鞘提供了重要标准;荧光显微镜常常被用于研究髓鞘相关蛋白的功能;核磁共振成像是目前在体诊断髓鞘相关疾病最实用的工具。这几种髓鞘成像方法为理解髓鞘的生理机能，诊断髓鞘相关疾病提供了重要的手段，然而它们都具有各自的局限性:电子显微镜和组织形态学只能观察固定的样本，不能进行活体在位观察;荧光显微镜需要对髓鞘蛋白进行荧光探针标记，而人们很难保证外源性的荧光探针整合后不会影响体内内源性髓鞘蛋白的正常功能;核磁共振成像是目前可以进行活体在位检查的工具，然而其成像分辨率十分有限，不能进行超微层面的观察。探测分子振动的能力保证了SRS显微镜可以对髓鞘进行无标记观察，避免了分子探针对髓鞘正常功能的干扰，非线性效应使得SRS显微镜可以进行三维层析成像，并且具有很好的成像分辨率。我们应用模式生物非洲爪蟾蝌蚪，利用其发育期身体透明的特征，避免了暴露神经系统手术操作的潜在损伤和干扰，使用SRS显微镜，我们分别观察了髓鞘的形成过程、郎飞氏节的成熟过程，以及脱髓鞘过程。我们的工作阐述了新的动物模型和成像工具用于研究髓鞘发育和髓鞘相关疾病。
　　目前常用的SRS显微镜需要两束空间上共线的超快激光光源作为激发光源，而超快激光器的昂贵价格大大地限制了SRS显微镜在普通生物学实验室和医学实验室的应用。为了降低SRS显微镜的成本，我们使用成本低廉的连续波激光器作为激发光源，搭建了连续波激光受激拉曼散射(cw-SRS)显微镜。在搭建 cw-SRS显微镜前，我们首先搭建了cw-SRS光谱检测装置。两个连续波半导体激光器被用作激发光源，其中一束波长可调的激光器作为泵浦(pump)光束，其波长范围为765-781 nm，另一束中心波长为982 nm激光器作为斯托克斯(Stokes)光束。斯托克斯光束以5.4 MHz的频率进行电压调制，泵浦光束发生受激拉曼损耗(stimulated Raman loss，SRL)过程，其信号频率和斯托克斯光束的调制频率一致。泵浦光和斯托克斯光在空间上完全共线，由10 mm的透镜聚焦在样本上，从样本上透射出的泵浦光被光电二极管检测，斯托克斯光被滤光镜滤除。光电二极管的输出信号包含了泵浦光自身的光强和SRL信号，泵浦光光强为直流信号，SRL为交流信号，其频率为5.4 MHz。用锁相放大器将SRL信号拾取出来，经放大后送至数据采集系统。进行光谱采集时，使用LabView程序控制泵浦激光器的波长范围，波长从766 nm扫描至776 nm，扫描步进为0.6 nm，对应的拉曼频谱为2700～2870 cm-1，不同波长对应的SRL信号由数据采集系统采集，并绘制成SRS光谱输出。我们用橄榄油、甲醇和环乙烷作为样本，分别取得了SRL光谱，和自发拉曼光谱完全一致。由于斯托克斯激光器直接被电压进行调制，获取的SRL信号具有很高的背景，为了消除背景，我们改用双调制模式检测和频信号，避开斯托克斯激光器电压调制引起的背景。我们将泵浦光束以0.8 MHz进行调制，斯托克斯光束以4.6 MHz进行调制，光电二极管检测5.4MHz的和频信号。由于和频信号的频率和斯托克斯光束的调制频率不同，双调制模式完全去除了背景噪声。之后我们将两束激光送入激光扫描显微镜中，对橄榄油和脂肪肝切片进行显微成像，并取得了cw-SRS图像。和皮秒脉冲激光器相比，连续波激光器激发的SRL信号弱103左右，这是因为连续波激光的能量比脉冲激光器的峰值能量弱103。连续波激光对生物组织的光损伤很小，理论上可以通过提高激发光的能量来提高SRS信号的强度。由于连续波激光器的低廉价格，cw-SRS显微镜大大降低了传统SRS显微镜的成本，这将开拓SRS显微镜在生物学和医学研究领域的更多应用。

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