首页> 中文学位 >基于光化学表面改性制备高灵敏度聚合物基基因芯片的研究
【6h】

基于光化学表面改性制备高灵敏度聚合物基基因芯片的研究

代理获取

目录

声明

摘要

符号说明

论文说明

第一章 绪论

1.1 在聚合物基材表面构造DNA微阵列

1.2 聚合物表面固定DNA的其他应用

1.3 无机材料上DNA微阵列的制备

1.4 环烯烃共聚物(coc)在微流体芯片中的应用

1.5 环烯烃共聚物(COC)在其他领域的应用

1.6 EVA在多种领域中的应用

1.7 本论文的创新点及主要研究内容

第二章 利用光催化氧化法在COC表面固定DNA

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂

2.2.2 仪器

2.2.3 COC表面环氧化

2.2.4 DNA固定

2.2.5 DNA杂交

2.3 结果与讨论

2.3.1 表面表征

2.3.2 DNA的固定

2.3.3 DNA杂交分析

2.4 结论

第三章 EVA表面三维图案化固定DNA探针

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂

3.2.2 仪器

3.2.3 EVA表面引入ITX

3.2.4 EVA-ITX表面引入PEG刷

3.2.5 在PEG刷表面引入环氧基反应柱

3.2.6 EVA表面的DNA微阵列

3.2.7 表征

3.3 结果与讨论

3.3.1 表面表征

3.3.2 不同因素对环氧反应柱高度的影响

3.3.3 DNA在微阵列上的固定

3.4 结论

第四章 原位光聚合制备基因芯片及杂交检测

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂

4.2.2 仪器

4.2.3 LDPE基材表面引入活性休眠基

4.2.4 LDPE表面引发活性接枝聚合PEGDA

4.2.5 LDPE表面微阵列构造

4.2.6 胶质瘤组织中RNA的提取

4.2.7 cDNA的双链化以及纯化

4.2.8 线性扩增转录合成cRNA

4.2.9 反转录成cDNA并荧光标记

4.2.10 将上述荧光标记的cDNA与凝胶微阵列芯片上的DNA探针杂交

4.3 结果与讨论

4.3.1 LDPE表面引入ITX

4.3.2 LDPE-PEGDA表面DNA探针反应液的铺展性

4.3.3 LDPE表面DNA三维凝胶微阵列的构造

4.3.4 提取的RNA与反转录合成的cDNA的检测

4.3.5 LDPE凝胶微阵列芯片上胶质瘤病变基因检测

4.4 结论

第五章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者简介

导师简介

展开▼

摘要

近年来,聚合物越来越广泛地被用作制备生物芯片的基底物质。重要的是:这些材料能被用于多种领域。聚合物具有众多优势比如低成本,坚固结构,易于构造,快速成型。使用聚合物基质一个重要的优点是它们提供了各种各样的表面性能,在某种情况下还能保留聚合物原有的性能。聚合物生物芯片制备技术是一种真正能代替普通玻璃基微阵列的技术。DNA微阵列体系通常是格式化的微型DNA探针,DNA芯片将有助于诊断和治疗的结合以及引入个性化的药物。生物分子的固定方法分为三类,基于共价结合,物理吸附,或者绑定相互作用的亲和力。共价结合常以氨基为基础。大多数用于绑定的机理依靠于N-羟基丁二酰亚胺(NHS),环氧基树脂,醛类,或者碳二酰亚胺,这些都能与生物分子上的氨基共价结合。本课题探讨了不同的共价结合方法用于在聚合物表面固定DNA,这对提高监测灵敏性和用于特定生物分析的生物芯片的选择性具有重要意义。本研究主要内容包括:
  ⑴COC有很多优良的特性,包括高的玻璃化转变温度,低自体荧光,光学透明性和耐有机溶剂等。本研究中,我们使用一种新颖的方法将环氧基引入到COC表面,基于光催化氧化法(CPO)。首先,利用CPO方法将硫酸根阴离子引入到COC表面,然后硫酸根阴离子通过水解作用转化成羟基,形成类玻璃表面,之后可以与硅烷偶联剂反应。我们选用环氧丙基三甲氧基硅烷将环氧基引入到COC薄膜表面,结果用XPS,水接触角测量仪和原子力显微镜表征。通过DNA末端的氨基与引入到COC表面的环氧基之间的共价结合实现DNA探针在COC表面的固定。不同浓度的DNA探针在COC表面的固定效率在45%~65%之间,与传统的环氧化玻片相比相差无几。得到的DNA微阵列与互补的靶基因实现了成功杂交,杂交后荧光强度是由固定探针的密度或者杂交反应液中靶基因的浓度决定。该方法在低成本的聚合物芯片的构造中有相当大的潜力。
  ⑵EVA是一种被广泛使用的乙烯共聚物,在EVA中极性的乙烯醋酸酯单元无规分散在结构中,使得EVA具有良好的柔韧性,光透过性能,并粘附其他有机/无机材料。首先作为光引发剂的异丙基硫杂蒽酮(ITX)在紫外光下引发共价结合到EVA表面形成异丙基硫杂蒽酮半频哪醇(ITXSP)休眠基。固定在聚合物表面的ITXSP可作为一种反应片段来引发乙烯基单体在可见光下的接枝。带有环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)被用作在EVA表面引入环氧基的功能性单体。首先在EVA表层可见光辐照接枝一层PEGDA抗污染层,再在表面二次可见光接枝一层功能性的微阵列。用3D结构制备DNA微阵列具有很重要的优势:有更高的固定能力同时在固定分子之间有更长的间距。利用一系列的表征方法证明EVA表面成功引入环氧基同时获得了更亲水的表面特性。利用原子力显微镜可以观察到二次可见光接枝GMA与PEGDA混合物的EVA表面有规整的带有一定高度的三维环氧反应柱,之后带有氨基的DNA探针与反应柱上的环氧基共价结合,利用扫描仪检测到EVA表面成功固定上了DNA。这为之后的基因检测以及更广泛的生物应用提供了有利因素。
  ⑶三维水凝胶微芯片的性能相对于二维平面微阵列芯片的优点是固定能力高,固定分子周围有均匀的水环境,固定化分子与疏水的基质表面没有接触,因此增加了芯片固定探针的稳定性。本研究开发了一种新的共聚过程用于三维凝胶反应柱的新型微芯片制备。使用氨基化的DNA,单体选用丙烯酰胺,氨基化的DNA能结合到增长的聚丙烯酰胺链上,首先将氨基化的DNA与形成凝胶的丙烯酰胺单体混合,之后用点样仪将聚合反应的混合物的液滴喷点到LDPE表面进行UV辐照引发DNA与丙烯酰胺之间的共聚合反应。结果显示DNA固定前后的固定效率大于80%,说明利用该方法DNA成功地引入到了LDPE表面。LDPE表面固定的凝胶柱的力学和热学性能都很稳定。这为进一步临床应用提供了依据。
  ⑷目前临床上检测胶质瘤病变级数的方法比较复杂而且不准确。利用上述方法制备的LDPE凝胶固定DNA微芯片检测胶质瘤病变级数。25条特异性的胶质瘤分级相关基因作为探针与从胶质瘤组织中提取的DNA探针进行杂交,观察杂交情况确定病变级数。本研究使用一级和四级病变级数的胶质瘤组织,先从组织中提取RNA,然后反转录成cDNA,并用Cy3或者Cy5荧光标记cDNA(靶基因),利用紫外分光光度计得到的紫外谱图出现了cDNA的特征吸收峰说明Cy3和Cy5成功标记在cDNA上。cDNA作为靶基因与25条特异性DNA探针杂交,用扫描仪观测到了明显的杂交结果。通过该方法我们可以利用杂交结果以及荧光强度的不同来确定未知的病变程度用于早期的疾病检测。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号