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在中国心脏移植患者中基因多态性对他克莫司体内药物浓度的影响研究

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主要仪器

摘要

前言

第一部分HPLC-MS／MS和CMIA法检测心脏移植患者全血他克莫司浓度的比较研究

研究目的

研究方法

研究结果

讨论

研究小结

第二部分在中国心脏移植患者中基因多态性对他克莫司体内药物浓度的影响

研究目的

研究方法

研究结果

讨论

研究小结

研究结论

参考文献

综述 基因多态性对免疫抑制剂PK／PD的影响

致谢

声明

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摘要

他克莫司(tacrolimus，FK506)是一种钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors，CNIs)，1989年首次应用于临床。FK506的结构虽然与环孢素A(Cyclosporin A, CsA)大不相同，但其作用的机制基本相似，主要是通过特异性抑制钙调磷酸酶活性，从而阻滞T细胞激活过程，同时还有CsA所不具备的T-细胞依赖性抗体的生成，阻滞细胞因子的转录，呈现双重的免疫抑制作用。其药效强度是CsA的10～100倍，它能有效地预防心脏移植术后排斥反应的发生，并具有较少的不良反应，但其药动学个体差异较大、治疗窗狭窄，而且易受其他合并用药的影响。因此，为了确保合适的暴露量，临床实施治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)是十分必要的。 目前FK506的检测方法主要有免疫法和液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)。虽然免疫法已实现商业化的规范操作，操作简单、方便、自动化程度高，然而，其灵敏度低、专属性弱，常因FK506代谢物的交叉反应，导致测定的浓度往往高于实际浓度。相反，HPLC-MS/MS只检测FK506母药的浓度，专属性强、准确度高，能校正免疫法的差异。 人体对药物反应的个体差异源于与药物药代动力学和药效学相关的各种功能蛋白的分子变异。有关分子变异的研究，主要集中在基因变异对于上述蛋白的表达和功能的影响。目前国内外有关FK506个体化用药研究主要集中在药物代谢酶（CYP3A4和CYP3A5）及转运体(P-gp)的遗传多态性上，但是有关药物代谢酶和转运体的调节因子、药效学途径中靶蛋白的遗传多态性与FK506血药浓度的研究较少，仍无定论。 本研究包括2部分内容，首先开发建立了测定人全血中FK506浓度的HPLC-MS/MS分析方法，并与临床TDM采用的CMIA方法比较，评价两种方法监测FK506浓度的相关性，以及两种方法在治疗药物监测中的应用，探讨在中国心脏移植患者中基因多态性对术后FK506血药浓度的影响，为实现FK506的个体化用药提供理论依据。 第一部分 HPLC-MS/MS和CMIA法检测心脏移植患者全血他克莫司浓度的比较研究 研究目的： 比较CMIA法与HPLC-MS/MS法监测FK506浓度的相关性，以及两种方法在治疗药物监测中的应用。 研究方法： 1.研究对象:心脏移植患者术后接受FK506治疗药物监测的全血样本(n=581)。 2.建立HPLC-MS/MS法测定全血中FK506的血药浓度，并与CMIA测定的结果进行比较，用Bland-Altman法进行一致性分析，计算95％参考区间(即一致限LoA)作为参考区域，若有至少95％的散点位于该一致限内，可认为两种方法的一致性较好。 3.用SPSS version19.0软件进行配对t检验和Pearson线性回归分析两种方法的测定结果，P＜0.05表示差异具有统计学意义。 研究结果： 1.开发建立HPLC-MS/MS测定人全血FK506浓度，线性范围2-30 ng/ml，定量下限为2 ng/ml;日内及日间精密度(RSD％)均小于15％。 2.按照Bland-Altman法计算，95.52％LoA=(0.2，5.6)，95.52％的差值都位于一致限内，两种方法测定值一致性良好。回归方程为yHPLC-MS/Ms=0.7011xCMIA-0.1668(R2=0.9024)，说明两种方法具有良好的相关性，CMIA方法的测定值较HPLC-MS/MS方法的测定值高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 第二部分 在中国心脏移植患者中基因多态性对他克莫司体内药物浓度的影响 研究目的： 探讨在中国心脏移植患者中基因多态性对FK506体内药物浓度的影响。 研究方法： 1.研究对象:2009-2017年阜外医院心脏移植术后服用FK506的200例患者作为实验组，100例健康人作为对照组。 2.心脏移植患者初次给予FK506，服药第2天晨起空腹抽取静脉血2 ml(EDTA抗凝)，采用CMIA法检测FK506的全血浓度(blood trough concentration，C0)。 3.基因多态性检测:采用PCR-直接测序法、PCR、MassArray(R) SNP方法对相关位点进行基因分型。 1) PCR-直接测序法: CYP3A5*3(rs776746 A＞G)，NR1I2(rs2276707 C＞T)，IL-10(rs1800872 C＞A), TGF-β1(rs1800470 C＞T), TGF-β1(rs1800471 G＞C) 2) PCR: ACE rs1799752 I＞D 3) MassArray(R) SNP: CYP3A5(rs28365085 T＞C,rs10264272 G＞A,rs4130334327131_27132insA), CYP3A4(rs35599367 C＞T, rs2740574 C＞T, rs28371759A＞G, rs2242480 C＞T, rs33972239 delA, rs4646437 A＞G, rs138105638 G＞A),CYP2C8*3(rs11572080 C＞T), ABCB1(rs1128503 C＞T, rs2032582 G＞T/A,rs1045642 C＞T,rs2229109 C＞T), SLCO1B1(rs2306283 G＞A),NR1I2(rs6785049 G＞A, rs3814055 C＞T), PPAR-α(rs4253728 G＞A, rs4823613A＞G), POR(rs1057868 C＞T, rs2868177 A＞G), COMT(rs165599 G＞A,rs2239393 A＞G, rs4646312 T＞C, rs4680 G＞A, rs6267 G＞T, rs737865 A＞G),IL-2(rs2069762 T＞G, rs2069763 C＞A), IL-3(rs181781 G＞A), IL-4(rs2070874T＞C), IL-6(rs1800796 G＞C, rs1800795 G＞C), IL-10(rs1800871 G＞A,rs1800896 A＞G), IL-18(rs1946518 T＞G), TNF-α-308(rs1800629 G＞A),TLR-4(rs1927907 G＞A), CTLA4(rs4553808 A＞G), PPP3CA(rs3804358 G＞C),PPP3CB(rs3763679 T＞C), PPP3R1(rs1868402 G＞A), CALM1(rs12885713C＞T) 研究结果： 1.除COMT rs165599, COMT rs6267和PPP3R1 rs1868402(P＜0.01)外，其它SNPs均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。患者组TGF-β1 rs1800470 C、 CYP3A5*3rs776746 G等位基因频率高于对照组(P=0.03); IL-6 rs1800796 C、 CYP3A4*1Grs2242480 C等位基因的频率低于对照组(P=0.03)。 2.心脏移植患者初始剂量给药后，对FK506 C0有统计学差异的基因位点: 1)纯合野生型高于杂合/纯和突变型:CYP3A4*1G、CYP3A4 rs33972239 2)纯合野生型低于杂合/纯和突变型:IL-2 rs2069762T＞G 3)纯合野生型/杂合低于纯和突变型:CYP3A5*3、 CYP3A4 rs4646437 A＞G、 4)纯和野生型低于纯和突变型:PPP3R1 rs1868402 G＞A 3.校正年龄、性别等因素后，多元线性回归结果显示，有2个基因多态性位点综合起来可解释23.1％的FK506血药浓度变异，而这23.1％中，CYP3A5*3解释了38.7％，IL-2 rs2069762 T＞G解释了15.6％。年龄、性别及CYP3A4*1G、CYP3A4rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437 A＞G、PPP3R1 rs1868402 G＞A均对FK506C0的影响均无统计学意义(P＞0.05)。 4.消除CYP3A5*3因素的影响后，CYP3A4*1G、CYP3A4 rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437 A＞G、PPP3R1 rs1868402 G＞A及IL-2 rs2069762 T＞G对FK506 C0的影响均无统计学意义(P＞0.05)。 研究结论： 1.LC-MS/MS方法定量检测全血中FK506的浓度，具有很好的专属性，不会与FK506体内代谢产物产生交叉反应，使得测量值更准确可信。 2.CMIA法和LC-MS/MS法在检测FK506血药浓度时具有良好的一致性和相关性，均可用于常规TDM。 3.在中国心脏移植患者中，FK506 C0与CYP3A5*3、IL-2 rs2069762 T＞G之间存在相关性。 4.通过基因分型，结合TDM常规，能客观地预测不同患者移植术后使用FK506的初始剂量，提高免疫治疗效果，降低毒性反应。

著录项

  • 作者

    金瑛;

  • 作者单位

    北京协和医学院;

    中国医学科学院;

    清华大学医学部;

    北京协和医学院中国医学科学院;

  • 授予单位 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院;
  • 学科 药理学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 田蕾;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类
  • 关键词

    中国; 心脏移植; 患者; 基因多态性; 他克莫司; 体内; 药物浓度;

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