胃泌素通过抑制肠道NHE3减少钠吸收参与盐敏感性高血压调节以及心脏特异性多巴胺D5受体缺失通过ROS和ERK1/2/JNK引起扩张型心肌病

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本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分:胃泌素通过抑制肠道NHE3减少钠吸收参与盐敏感性高血压调节目的:本研究通过化学方法将胃泌素连接到SiO2微粒表面，使其在进入机体后，只作用于胃肠道的肠上皮细胞，而不被吸收进入机体，运用动物实验和细胞实验，从一个新的角度探索胃泌素在血压调节中的作用，同时也为其作为高血压的治疗的新靶点提供充分的证据。方法:动物实验一：使用Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐不敏感性大鼠，分别分为3组：对照组（0.4％NaCl）、高盐组(8％NaCl)、高盐+胃泌素处理组(8％NaCl+gastrin(0.2mg/kg/day))。每天同一时间使用尾袖法测量大鼠血压;使用代谢笼收集Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠不同组的大鼠的尿液，检测大鼠尿钠和尿肌酐的含量;通过质谱法检测大鼠体内是否含有合成胃泌素;免疫荧光共定位检测Dahl大鼠小肠刷状缘上胃泌素受体和NHE3是否发生间接或直接的作用;免疫荧光检测Dahl大鼠高盐喂养之后小肠刷状缘膜上NHE3的位置改变和高盐喂养的同时给予胃泌素灌胃对NHE3位置改变的作用;获取3组Dahl盐敏感性大鼠小肠绒毛刷状缘膜蛋白，使用western blot的方法检测小肠刷状缘膜上NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT的表达。动物实验二：制备胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+)，分别分为两组：对照组(0.4％NaCl)和高盐组(6％NaCl)，颈动脉插管法检测小鼠血压;使用代谢笼收集CCKB受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组和高盐组的尿液，检测尿钠和尿肌酐的含量;使用western blot的方法检测CCKB受体敲除小鼠(CCKBR-/-)和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组和高盐组小肠刷状缘膜上NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT的蛋白表达。结果:动物实验一：Dahl盐敏感性大鼠经过高盐喂养之后，血压显著高于对照组大鼠的血压，高盐+胃泌素处理组大鼠的血压相比于高盐组大鼠血压显著的降低(P＜0.05);而SS-13BN盐耐受性大鼠各组之间的血压并无明显的差异;Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠高盐组的尿钠水平和对照组相比显著增加(P＜0.05)，但SS-13BN盐耐受性大鼠高盐组的尿钠排泄水平高于Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组;Dahl盐敏感性大鼠和SS-13BN盐耐受性大鼠高盐+胃泌素组的尿钠水平和两种大鼠的高盐组相比显著降低(P＜0.05);免疫荧光共定位显示，在Dahl盐敏感性大鼠中NHE3和胃泌素受体共定位于小肠绒毛的刷状缘膜上;免疫荧光结果显示，Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组和对照组相比，NHE3向小肠绒毛刷状缘膜上转移增加，高盐+胃泌素组和高盐组相比，NHE3由小肠绒毛刷状缘膜向细胞内转移;Western blot结果显示，Dahl盐敏感性高血压大鼠高盐组和对照组相比，小肠绒毛刷状缘膜上NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT表达显著增加(P＜0.05)，给予胃泌素处理后，这些蛋白的表达量与高盐组相比显著减少(P＜0.05)。动物实验二：胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)对照组和野生型小鼠(CCKBR+/+)对照组相比收缩压显著升高，胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组和野生型小鼠（CCKBR+/+）高盐组和各自的对照组相比，血压进一步升高，但胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组血压高于野生型小鼠(CCKBR/+)高盐组血压;胃泌素受体敲除小鼠（CCKBR-/-）对照组和野生型小鼠（CCKBR/+）对照组相比，尿钠水平显著降低，胃泌素受体敲除小鼠(CCKBR-/-)高盐组和野生型小鼠（CCKBR+/+）高盐组相比，尿钠水平显著降低(P＜0.05);胃泌素受体敲除小鼠（CCKBR-/-）对照组和野生型小鼠(CCKBR/+)对照组相比，小肠绒毛刷状缘膜上NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT表达显著增加(P＜0.05），高盐饮食之后这些蛋白的表达进一步增加。体外实验证实，Caco-2细胞高盐组和对照组相比细胞膜上NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT表达显著增加(P＜0.05)，胃泌素能够显著阻断高盐引起的蛋白表达升高(P＜0.05)，而PLC和PKC抑制剂则能够显著减少组胃泌素引起的NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3，ezrin和IRBIT的表达减少(P＜0.05)。结论:胃泌素能够通过PLC/PKC途径，抑制NHE3，NHERF1，NHERF2，NHERF3,ezrin和IRBIT形成大分子复合物，从而促使小肠绒毛刷状缘膜上NHE3向细胞内转移，降低NHE3在小肠刷状缘膜上的表达，缓解高盐饮食引起的血压升高，可能成为高血压治疗的新靶点。第二部分:心脏特异性多巴胺D5受体缺失通过ROS和ERK1/2/JNK引起扩张型心肌病目的:本研究通过动物实验和细胞实验两方面研究多巴胺D5受体在扩张型心肌病发生发展过程中的具体作用机制。方法:制备心脏特异性表达人D5受体转基因的小鼠（hD5F173L-TG）和心脏特异性表达人D5正常受体转基因小鼠（hD5WT-TG）;构建表达人多巴胺D5受体突变基因的H9c2细胞（H9c2-hD5F173L）和表达人多巴胺D5受体正常基因的H9c2细胞(H9c2-hD5WT);超声检测并比较hD5F173L-TG小鼠和hD5WT-TG小鼠的心脏功能并给予3月龄的hD5F173L-TG小鼠apocynin处理后观察心脏功能的改善;颈动脉插管法检测hD5F173L-TG小鼠和hD5WT-TG小鼠血压变化;使用光泽精方法检测小鼠心脏和转染人多巴胺D5受体的H9c2细胞中NADPH氧化酶活性;使用ELISA的方法检测转基因小鼠心脏和转染人多巴胺D5受体的H9c2细胞ROS的产量;Westernblot检测小鼠心脏中P40phox、P47phox、Nrf2、Nrf2下游信号分子NQO1和HO1以及心脏损伤标志物PLN、SerCa2、BCL-2、BAX和信号通路分子p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38和P38的表达量以及apocynin处理后这些蛋白表达的变化，检测H9c2-hD5WT和H9c2-hD5F173L细胞中P40phox、P47phox、Nrf2、Nrf2下游信号分子NQO1和HO1的表达;免疫荧光检测Nrf2、BAX、BCL-2和JNK在H9c2-hD5WT和H9c2-hD5F173L细胞中表达变化，检测使用Nrf2抑制剂(ML385)后对BAX、BCL-2和JNK的表达的作用;免疫共沉淀检测3月龄和4月龄的hD5F173L-TG小鼠心脏Nrf2和泛素化蛋白的相互作用;Western blot检测H9c2-hD5WT和H9c2-hD5F173L细胞中P40phox、Nrf2、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白表达，以及使用PKA抑制剂(H89)和PKG抑制剂(KT5823)后蛋白表达的变化。结果:动物实验发现，与hD5WT-TG小鼠相比，hD5F173L-TG小鼠心脏的左室收缩末期和和舒张末期容积，左室收缩末期和舒张末期内径显著增大，射血分数和左室短轴缩短率显著降低，心脏重量明显增加，心肌发生明显的纤维化，但血压无显著性差异。给予apocynin处理之后，hD5F173L-TG小鼠心脏功能较未处理组得到了显著的改善。与hD5WT-TG小鼠相比，hD5F173L-TG小鼠心脏NADPH氧化酶活性和ROS产量显著增加，NADPH氧化酶的调节亚基P40phox和P47phox在细胞膜上表达显著增加，使用apocynin处理后hD5F173L-TG小鼠心脏NADPH氧化酶活性降低，细胞膜上P40phox和P47phox表达降低，但ROS产量降低程度低于NADPH氧化酶的降低程度。细胞实验我们发现，与H9c2-hD5WT细胞相比，H9c2-hD5F173L细胞NADPH氧化酶活性，ROS的产生以及P40phox和P47phox的基础表达量都明显增加。机制研究发现，hD5F173L-TG小鼠3月龄时Nrf2、NQO1和HO1表达轻度增加，但是在4月龄时表达显著降低，apocynin对这些蛋白的表达没有显著作用，且3月龄时Nrf2泛素化轻微降低，在4月龄时泛素化显著增加。在H9c2-hD5WT细胞中Nrf2主要表达在细胞浆，而在H9c2-hD5F173L细胞中Nrf2在细胞核中表达增多。hD5F173L-TG小鼠心脏PLN、SerCa2、BAX和BCL-2以及p-JNK和p-ERK 1/2表达增加，使用apocynin后表达显著降低。使用PKG抑制剂能够显著抑制H9c2-hD5F173L细胞中P40phox、p-JNK和pERK1/2的表达。结论:多巴胺D5受体通过抑制NADPH氧化酶活性，同时促进Nrf2转运入核表达抗氧化蛋白激活ERK/JNK通路，从而发挥抑制氧化应激的作用最终避免扩张性心肌病损伤。

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作者
刘云鹏;
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作者单位

北京协和医学院;

中国医学科学院;

清华大学医学部;

北京协和医学院中国医学科学院;

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授予单位北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院;
学科比较医学
授予学位博士
导师姓名魏强,杨志伟;
年度 2018
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类自动化技术及设备;仪器、仪表;
关键词
胃泌素; 抑制; 肠道; NHE3; 吸收; 盐敏感性; 血压调节; 心脏; 特异性; 多巴胺; 受体; 缺失;

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1. 多巴胺 D5受体通过抑制氧化应激对扩张型心肌病的调节作用 [J] . 王子皓 ,胡永艳 ,王文洁 . 中国比较医学杂志 . 2015,第005期
2. CRF通过激活ERK1/2通路参与调节肠易激综合征大鼠肠道树突状细胞表型改变 [C] . 李蒙 ,胡玥 ,王霄腾 . 第二十七届全国中西医结合消化系统疾病学术会议 . 2015
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